Сокращения: ДК ― дендритные клетки, ИЛ ― интерлейкин, ЛАК ― лимфокинактивированные киллеры, НК ― натуральные киллеры, ППС ― полная питательная среда, Т ― температура тела, ЧСС ― частота сердечных сокращений, ЧД ― частота дыхания, МТТ – 3-(4,5-диметилтиазол-2)-2,5-дифинилтетразолиум бромид. ВведениеВ настоящее время клеточная иммунотерапия все чаще используется в клинической практике лечения пациентов с онкологическими заболеваниями. В основе данного подхода лежит выделение из организма донора или самого больного иммунокомпетентных клеток, их культивация ex vivo с целью пролиферации, активации различными биоактивными агентами экзо- и эндогенного происхождения, и, наконец, последующего введения в организм больного. Использование данного подхода позволяет получать различные продукты клеточных технологий; некоторые такие продукты были успешно апробированы в клинической онкологии человека. В частности, для лечения фолликулярной и диффузной неходжкинских лимфом применяют препарат ритуксимаб, который представляет собой химерные моноклональные антитела, специфичные к CD20–антигену, обнаруживаемому на мембране B-лимфоцитов [1]. В составе комплексного лечения пациентов с меланомой, как в медицине человека, так и в ветеринарной практике, применяется вакцина на основе дендритных клеток, индуцирующая активацию иммунного ответа, опосредуемого Т-лимфоцитами [2]. Как было показано в серии исследований in vitro и in vivo, ДК способны активировать в организме как неспецифический, опосредуемый НК, так и специфический противоопухолевый иммунный ответ, опосредованный Т-лимфоцитами [3]. В последнее время большие надежды в борьбе с онкологическими заболеваниями связаны с применением специфических антител, таких как PD-1 (от англ. programmed cell death protein 1) и CTLA-1 (от англ. cytotoxic T-lymphocyte–associated antigen 4). Было показано, что применение указанных специфических антител блокирует PD-1 и CTLA-1 ̶ опосредованные сигнальные пути в Т-лимфоцитах, активируя специфический иммунный ответ, обусловленный цитототоксической реактивностью, антиген-презентирующей и цитокин-индуцирующей функциями [4, 5].Важно помнить, что иммунотерапия наиболее эффективна после процедуры циторедукции и, кроме того, ее успех во многом зависит от качества оперативного вмешательства и/или лучевой терапии. Следует отметить, что применение продуктов клеточных технологий рассматривается как эффективный инновационный подход для лечения в аддитивном режиме пациентов со злокачественными опухолями, осложненными развитием опухолевых серозитов [6]. В частности, имеется значительное число публикаций о положительном опыте применения в клинической практике ЛАК против опухолевых асцитов, плевритов, перикардитов [7].Вышеизложенное справедливо и для ветеринарной медицины, где высока потребность в новых эффективных иммунотропных средствах борьбы с онкологическими заболеваниями. Известно, что только в США каждый год у 6 миллионов собак регистрируют онкологические заболевания [8, 9]. Однако в настоящее время число публикаций о разработке и оценке новых средств клеточной иммунотерапии с противоопухолевой активностью остается небольшим. При этом обоснованность большинства из предложенных методов противоопухолевой иммунотерапии базируется на экстраполяции результатов, полученных специалистами медицины человека [10]. Было отмечено, что средств иммунотерапии, созданных с помощью клеточных технологий, разработанных и апробированных специально для лечения собак и кошек, пока очень мало. В основном, немногочисленные данные об эффективности применения рассматриваемых инновационных продуктов были получены в ходе тестирования на этих животных разработок, предназначенных для медицины человека. В частности, на собаках были протестированы противоопухолевые вакцины и один из типов генетически модифицированных антигенспецифических Т-клеток [11, 12]. Однако вопросам оценки безопасности для собак разрабатываемых клеточных продуктов внимания было уделено в объеме, недостаточном для формирования картины развития возможных осложнений. Цель исследованияОценить влияние инфузии суспензии ЛАК (мононуклеарных лейкоцитов крови, активированных ИЛ-2 ex vivo) на клинические, биохимические, гематологические и иммунологические показатели здоровой собаки породы бигль, чтобы сделать вывод о безопасности применения данного продукта клеточных технологий, а также о путях коррекции стратегии его применения в клинической ветеринарной практике. Методы генерации и идентификации ЛАК, режим введения и дозировка клеток были определены на основе предварительных исследований [13]. Материалы и методыОбъект исследования ― собака породы бигль, самец, возраст 6 лет (рис. 1). Непосредственно перед началом, а также в процессе эксперимента собака содержалась в условиях стационара клиники экспериментальной терапии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России на стандартном рационе, при свободном доступе к воде. Перед началом эксперимента было проведено комплексное исследование физиологических, биохимических и гематологических параметров собаки, которое показало, что животное на момент начала эксперимента находится в удовлетворительном состоянии, все биохимические и гематологические показатели в пределах физиологических норм. У животного были измерены ЧСС, ЧД, Т, систолическое и диастолическое давление, также были оценены показатели клеточного иммунитета (иммунофенотип лейкоцитов крови, НК-активность, фагоцитарная активность клеток крови). Также было проведено рентгенологическое исследование легких. Это позволило установить исходный (базовый) уровень изучаемых параметров.Суспензию ЛАК в растворе Хенкса в дозе 25 млн клеток в объеме 5 мл вводили внутривенно с малой скоростью. За период введения не было отмечено признаков изменения реактивности, озноба, тремора, саливации, нарушений дыхания, объективных признаков боли, гиперемии конъюнктивы и слизистых покровов полости рта и носа. Затем в течение 5 суток проводили мониторинг физиологических параметров (первые 3 ч ― каждые 15 минут, далее ― каждые 12…24 часа), иммунологических и гематологических параметров (через 4 ч после введения ЛАК и через 48 ч). Динамику иммунологических параметров животного оценивали на базе лаборатории клеточного иммунитета НИИЭДиТО.Исследовали аутологичную культуру ЛАК, генерированную из венозной крови собаки. Генерацию культуры и оценку морфологии, фенотипа, активности целевых ЛАК выполняли на базе лаборатории клеточного иммунитета НИИЭДиТО.Рис. 1. Собака Купер породы бигль, послужившая биологическим объектом данного экспериментального исследованияFig. 1. The Beagle dog ― a biological object of the research Венозную кровь собаки стабилизировали 3,8%-м раствором цитрата натрия (1,1 мл раствора на 9 мл крови), смешивали с раствором Хенкса (ПанЭко, РФ) 1:1, наслаивали на градиент фиколла (плотность 1,077) и центрифугировали 20 мин при 1500 мин-1, 20 °С. Затем собирали клетки на границе фаз и двукратно отмывали их средой RPMI-1640 (ПанЭко, РФ), центрифугируя пробирки при 300g в течение 5 мин. Выделенные лейкоциты суспендировали в ППС на основе RPMI-1640, содержащей 5 % фетальной бычьей сыворотки (HyCloneLaboratories, Thermo), 2 мM L-глутамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл сульфата стрептомицина (ПанЭко, Россия).Морфологию клеток оценивали с помощью световой микроскопии. Клетки подсчитывали в камере Горяева после окрашивания трипановым синим (ПанЭко, РФ). Клеточную суспензию разливали в 3 флакона Nung по 10 мл. В два флакона для генерации ЛАК добавляли препарат рекомбинантного ронколейкина (500 МЕ/мл), третий оставляли без дополнительных добавок в качестве контроля лейкоцитов. Флаконы с клетками культивировали в течение 3 суток в СО2-инубаторе NUAir при 37 °С, 5 % СО2.По окончании срока инкубации клетки отмывали от ростовой среды центрифугированием в течение 5 минут при 300g. Осадок ресуспендировали в растворе Хенкса. Затем на клеточном анализаторе MuseMillipore определяли количество живых клеток (рис. 2). Рис. 2. Результаты определения концентрации живых клеток в культуре лейкоцитов крови через 3 суток после начала инкубации в среде с ИЛ-2. Viability ― жизнеспособность, Live ― живые, Dead ― мертвые, Population profile ― популяционный профиль, Viability profile ― профиль жизнеспособности, Cell Size Index ― показатель размера клеток, Nucleatedcells ― клетки с ядром, Debris ― обломкиFig. 2. Living cells concentration in leukocyte culture after 3 days of incubation in  IL-2 evironment Согласно полученным данным, концентрация целевых клеток в культуре соответствовала 3,77×106 в 1мл. Жизнеспособность ЛАК соответствовала 85,6 %. Следовательно, концентрация живых клеток соответствовала 3,23×106 в 1мл. Общий объем составил 10 мл. Подготовленная  клеточная суспензия была использована для характеристики свойств ЛАК конечной генерации и для введения собаке.Для морфологических и цитологических исследований посредством световой микроскопии использовали приборы Axioplan 2 CarlZeiss и Axiovert 40 СFL CarlZeiss. Концентрацию клеток определяли при рутинном подсчете в камере Горяева после окрашивания трипановым синим (ПанЭко, РФ). Иммунофенотип клеток оценивали по экспрессии ряда поверхностных маркеров с помощью моноклональных антител, конъюгированных с флуорохромами, на цитофлюориметре BD Canto II (BectonDickinson, USA). В качестве контроля использовали неиммунные, меченые FITC и ремоноклональные антитела того же изотипа, что и антитела против исследуемого маркера. В каждом образце анализировали не менее 10000 клеток. Оценивали относительное количество клеток, экспрессирующих целевые маркеры, а также интенсивность свечения (MFI) меченных клеточных популяций. Результаты проточной цитометрии анализировали в программе FACS Divaversion 3.1.0. Для подсчета количества живых и мертвых клеток использовали клеточный анализатор MuseMillipore и набор реактивов для него. Полученные с этого прибора результаты анализировали в программе Muse 1.4 Analysis. НК-активность клеток–эффекторов (ЛАК и контрольных лейкоцитов) оценивали с помощью МТТ теста. В качестве клеток-мишеней использовали клетки миелоидного лейкоза человека линии К-562. Соотношение клеток-эффекторов и клеток-мишеней ― 3/1. Длительность коинкубации ― 48 ч. Результаты анализировали на планшетном ридере LabsystemMultiscanMS, ThermoSc., Finland.Первичные данные обрабатывали с использованием модуля «Базовая статистика», «Множественная регрессия» и «Непараметрическая статистика» пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft). В качестве характеристик полученных выборок использовали среднее (χ), стандартное отклонение среднего (SD). Сравнительный анализ данных проводили с использованием t-критерия. Отличия считали достоверными при р< 0,05.Пролиферацию лейкоцитов крови оценивали на 3-и сутки культивирования клеток с использованием световой инвертированной микроскопии нативной культуры (рис. 3).a)b)c)d) Рис. 3. Пролиферация лейкоцитарных клеток крови собаки под воздействием ИЛ-2 (a…c) в сравнении с контролем (d). ×200Fig. 3. Leukocyte cells proliferation under IL-2 influence (a...c) and in the control group (d). x200Продемонстрировано, что на момент регистрации результатов в культуре ЛАК отмечали наличие отдельных небольших клеточных конгломератов ― 4…7 в поле зрения (увеличение ×200). В контрольном флаконе, где изолированные из крови лейкоциты инкубировали в среде без добавления ИЛ-2 формирование подобных пролифератов было отмечено в незначительном количестве ― 0…1 в поле зрения, что свидетельствует о усилении пролиферативной активности лейкоцитарных клеток крови собак под воздействием ИЛ-2.Чтобы оценить пролиферативную активность, исследовали динамику концентрации Ki67+ клеток в культуре ЛАК (3-и сутки инкубации) в сравнении с исходным уровнем (сразу после выделения лейкоцитов из крови собаки). Исследовали посредством проточной цитометрии на цитофлуориметре BDCantoII. Результат эксперимента рассчитывали, вычисляя среднее значение измерений в триплетах. Полученные данные указывают на достоверное увеличение пролиферации лейкоцитарных клеток под воздействием ИЛ-2: на 3-и сутки инкубации концентрация KI67+ клеток возросла в среднем 5,6 раз, р=0,016 (рис. 4). a)b)Рис. 4. Гистограммы, демонстрирующие нарастание концентрации Ki67+ клеток в культуре ЛАК собаки после 3 суток инкубации: a ― исходный уровень; b ― через 3 суток инкубации в среде с ИЛ-2Fig. 4. Hystograms showing increase of Ki67+ cells concentration in the canine LAC culture after 3 days of incubation in the IL-2 environment Фенотип ЛАК исследовали посредством проточной цитометрии на цитофлуориметре BDCantoII. На первом этапе по соотношению прямого и бокового светорассеивания были выделены гейты, соответствующие отдельным субпопуляциям лейкоцитов ― лимфоцитам, моноцитам, гранулоцитам (рис. 5). Использование такого подхода позволило оценить не только суммарное изменение уровня экспрессии маркеров на всех клетках культуры, но и вклад в него отдельных субпопуляций. Рис. 5. Выделение гейтов субпопуляций лейкоцитов крови собаки по соотношению прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеиванияFig. 5. Selection of canine leukocyte subpopulation gates based on FSC and SSC proportion В процессе инкубации исследовали динамику экспрессии на клетках культуры молекул CD5 (маркер лимфоцитов), CD4 (маркер Т-хелперов, у собак экспрессируется также на гранулоцитах и моноцитах) , CD8 (маркер Т-киллеров), CD25 (рецептор к ИЛ-2), CD34 (маркер низкодифференцированных гемопоэтических клеток).В процессе инкубации лейкоцитов в среде с ИЛ-2 наблюдали значительное увеличение концентрации лимфоцитов (количество CD5+ клеток увеличилось в 11 раз) на фоне относительного снижения количества CD4+ клеток с 81,4 % до 24,5 % и возрастания уровня CD8a+ клеток с 0,85 до 8 % (табл. 1). 1.      Динамика мембран-ассоциированных маркеров, %, на клетках культуры ЛАК собаки1. Membrane-associated markers’ dynamics on the canine LAC cell cultureСрок исследованияCD4CD8CD5CD34CD25Исходный уровень81,40,83,50,50,6В процессе инкубации:1-е сутки3-и сутки  13,824,5  2,98  15,137,9  1,81,2  1,20,8  Измерение неспецифической противоопухолевой реактивности клеток, реализуемое за счет активности НК, после генерации в среде с ИЛ-2 оценивали в сравнении с эффективностью лейкоцитов в контроле, где клетки культивировали в ППС без ИЛ-2 в условиях, аналогичных ЛАК. Исследовали с использованием МТТ-колориметрического метода, оптическую плотность раствора формазана измеряли в триплетах на планшетном ридере MSMultiscan при 540 нм.На рисунке 6 приведены фотографии морфологии клеток, полученные с использованием световой микроскопии после окраски МТТ.а)b) с)       Рис. 6. Противоопухолевая реактивность ЛАК, окраска МТТ: a ― контроль клеток-мишеней; b ― контроль клеток-эффекторов, c ― киллинг опухолевых клеток. ×200 (слева); ×400 (справа)Fig. 6. LAC antineoplastic reactivity. MTT staining. a ― target cells control, b ― effector cells control, c ― tumor cells killing. x200 (left), x400 (right) Было обнаружено достоверное (р<0,05) увеличение НК-активности ЛАК в сравнении с реактивностью контрольных лейкоцитов, культивируемых в отсутствии ИЛ-2 (рис. 7). При сравнении средних значений установлено, что неспецифическая противоопухолевая активность ЛАК превышала эффективность нестимулированных клеток более чем в 2 раза. Рис. 7. Сравнительная НК-активность ЛАК и контрольных лейкоцитовFig.7 Comparative NK-activity of LAC and control leukocytes  Результаты и обсуждениеВ процессе наблюдения за животным колебания оцениваемых параметров происходили в пределах нормативных показателей. Тем не менее, продемонстрирована тенденция относительно кратковременного периода (около 1 ч) колебания оцениваемых параметров, наблюдаемого в течение 45…105 минут после введения активированных клеток. В частности, через 45 минут после введения наблюдали тенденцию нарастания Т, ЧД, ЧCC, снижения систолического давления. После 120 мин наблюдали постепенную нормализацию этих показателей (табл. 2).2.      Динамика параметров физиологического состояния животных после введения ЛАК2. Animal physiological parameters’ dynamics after infusing LAC Время после введения ЛАКТ, °СЧСС, уд/минЧД, дых /минКровяное давление, мм рт.ст. суткиминутысистолическоедиастолическое1037,91152418979 1538,110428232104 3038,1952419084 4538,812136137119 6038,711544190110 7538,711846202117 9038,5953620691 10538,51026021084 12037,911828215105 1353810028215105 1503810228205100 12037,911828215105 1353810028215105 1503810228205100 33038100322051202144038,310424175963288038,591241891045576038,3672614956         Аппетит и когнитивная реактивность животного не претерпели изменений в период наблюдения после введения ЛАК. Не отмечали признаков саливации, патологической жажды, отсутствия или извращения аппетита. Не отмечены какие-либо признаки местных или системных патологических реакций, свидетельствующих о развитии органной недостаточности.Рентгенологическое исследование области грудной клетки собаки не показало формирование признаков развития патологических изменений тканей легких. В частности, не выявлено признаков диффузного уплотнения легочной ткани, наличия экссудата или транссудата в перикардиальной и плевральной полостях. 3.      Гематологические показатели собаки после введения ЛАК в сравнении с исходным уровнем3. Hematological parameters of the dog after LAC infusion compared to the initial level ПараметрВремя после введения ЛАК, ч0448Эритроциты, 10^12/L7,998,088,32Гемоглобин, g/dL18,418,719,5Тромбоциты, µL274263195Нейтрофилы, %62,970,659,2Лимфоциты, %21,817,825,2Моноциты, %7,15,47,8Эозинофилы, %7,95,87,6Базофилы, %0,30,40,2Лейкоциты, 109/L15,2113,8312,87Нейтрофилы, 109/L9,579,767,62Лимфоциты,109/L3,322,463,24Моноциты, 109/L1,080,751,01Эозинофилы, 109/L1,20,80,98Базофилы, 109/L0,040,060,02Контроль гематологических показателей был проведен на анализаторе IDEXXProCyteDx, откалиброванного для оценки клеток крови собак через 4 и 48 ч после введения ЛАК (табл. 3).Приведенные данные показывают, что за период наблюдения, оцениваемые гематологические показатели животного колебались в пределах нормы. Была отмечена тенденция нарастания концентрации эритроцитов и гемоглобина через 48 ч после введения ЛАК (рис. 3). Через 4 ч после введения активированных клеток наблюдали незначительный подъем относительного содержания нейтрофилов в крови, что не отразилось в изменении абсолютного количества этих клеток в кровотоке.В целом, следует отметить, что поскольку не было отмечено нарастания лейкоцитоза, введение ЛАК в использованной концентрации не вызывало развития системных реакций воспаления или отторжения. Это позволяет сделать вывод об отсутствии у ЛАК гематологической токсичности.Анализ иммунологических параметров клеток крови собаки проводили параллельно с оценкой гематологических показателей, сравнивая полученные данные с исходным уровнем. Были изучены иммунофенотип клеток крови собаки и активность иммунокомпетентных клеток ― неспецифическая противоопухолевая NK-активность и фагоцитарная активность гранулоцитов крови (рис. 8). Рис. 8. NK-активность лейкоцитов крови собаки после введения ЛАК в сравнении с исходным уровнемFig.8 NK-activity of canine leukocyles after LAC infusion compared to the initial level.  Сравнительный анализ показал отсутствие статистически достоверных различий реактивности NK собаки через 4 и 48 ч после введения ЛАК в сравнении с исходным уровнем.Фагоцитарную активность гранулоцитов собаки оценивали по способности поглощать бактерии E. coli с использованием проточной цитометрии. Изменений фагоцитарной активности гранулоцитов после введения ЛАК зафиксировано не было (рис. 9).abc Рис. 9. Фагоцитарная активность лейкоцитов крови собаки: исходный уровень (a), через 4 ч (b) и 48 ч (c) после введения ЛАКFig.9. Phagocytic activity of canine leukocytes: baseline (a), 4 hours (b), and 48 hours (c) after LAC infusion Фенотип лейкоцитов крови изучали после лизиса эритроцитов с использованием реагента OptiLyse согласно инструкции производителя. На точечном графике, показывающем зависимость прямого светорассеивания от бокового, выделяли гейты субпопуляций лейкоцитов (рис. 10). Рис. 10. Гейтирование лейкоцитов различных субпопуляций крови собаки после лизиса эритроцитовFig. 10. Various subpopulations of canine leukocytes gating after erithrocytolysis Было показано, что уже через 4 ч после введения ЛАК изменяется соотношение CD4/CD8 субпопуляций лимфоцитов в сторону снижения индекса. Указанный дисбаланс может быть до некоторой степени обусловлен относительно повышенной экспрессией маркера CD8 на мембранах ЛАК, циркулирующих в кровотоке после введения. Уже через 2 суток данный показатель нормализовался. Снижение содержания в крови CD25 лимфоцитов может быть обусловлено относительным уменьшением их концентрации на фоне кратковременного возрастания количества гранулоцитов (см. данные изучения гематологических параметров). Через 48 ч после введения значение этого показателя возросло с 2,8 % до 4,9 %, что незначительно превышало показатели исходного уровня.Таким образом, в ходе исследования была проведена генерация культуры ЛАК собаки: количество живых клеток составило 323×106/мл. Клетки были идентифицированы по нарастанию пролиферации Ki67+ клеток, количества CD5+ клеток (Т- и В-лимфоцитов), концентрации Т-киллеров (CD8+ клеток) и активированных клеток (CD25+ клеток), усилению их неспецифической противоопухолевой активности (НК-активности). Полученная аутологичная культура была введена внутривенно, болюсно, медленно собаке породы бигль в количестве 25 млн клеток. Мониторинг физиологических показателей животного продемонстрировал кратковременные колебания в пределах границ нормы температуры тела, усиления ЧСС и ЧД, снижение кровяного давления через 45 минут после введения клеток длительностью 1 ч. В дальнейшем описанные показатели вернулись к исходному уровню. Поскольку анализ гематологических и иммунологических параметров животного в сочетании с результатами рентгенологического исследования не выявил признаков развития каких-либо патологических процессов в организме животного после введения активированных клеток, можно сделать вывод об отсутствии местного или системного токсического воздействия ЛАК в данном количестве. ВыводыПолученные в ходе проведенного исследования данные представляют интерес и для медицины человека и для ветеринарной медицины, поскольку могут рассматриваться как часть доклинических испытаний готового продукта ― суспензии ЛАК, эффективность которой в клинической онкологии человека уже была подтверждена, и как пример оценки безопасности более сложных конструктов на основе активированных иммунокомпетентных клеток, еще находящихся в стадии разработки.Проведенные исследования могут послужить основой для разработки моделей изучения токсичности средств клеточной противоопухолевой иммунотерапии на основе активированных лейкоцитов (ЛАК, иммунные «checkpointmolecules» и СAR), а также рассматриваться как часть доклинических исследований токсичности ЛАК.Однако есть сведения о развитии у части пациентов в течение и после инфузии иммунного препарата симптомов «цитокинового шторма» ― повышение Т, озноба, нарушения работы дыхательной и сердечнососудистой систем. Поэтому оценке эффективности и применению методов иммунотерапии, как и других терапевтических средств должны предшествовать токсикологические исследования для выяснения доз, режимов и способов введения препаратов. Конфликт интересовАвторы не получали спонсорской помощи от производителей препаратов, указанных в данной работе, или их поставщиков.