Сокращения: АлАТ ‒ аланинаминотрансфераза, АсАТ ‒ аспартатаминотрансфераза, Гамма ГТ ‒ гамма‑глютамилтранспептидаза, ДВ ‒ действующее вещество, МПД ‒ максимальная переносимая доза, МТ ‒ масса тела, НРДТК ‒ непрямая реакция дегрануляции тучных клеток, ЩФ ‒ щелочная фосфатаза, HGB ‒ hemoglobin (гемоглобин), HCT ‒ hematocrit (гематокрит), MCH ‒ mean cell hemoglobin (среднее содержание гемоглобина в эритроците), MCHC ‒ mean cell hemoglobin concentration (средняя концентрация гемоглобина в эритроците), MCV ‒ mean cell volume (средний объем эритроцита), PLT ‒ platelets (тромбоциты), RBC ‒ red blood cells (эритроциты), WBC ‒ white blood cells (лейкоциты)Препарат разработан и выведен на рынок при финансовой поддержке Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфереВведениеТразодон ‒ селективный антагонист и ингибитор обратного захвата серотонина [13], который с начала 70-х гг. используется в медицине как средство для лечения различных форм депрессий, сопровождающихся чувством тревоги [2]. Интерес ветеринарных врачей, вызванный возможностью применения тразодона гидрохлорида для модификации поведения животных-компаньонов в различных ситуациях, связанных со страхом, тревогой и стрессом, был продиктован безусловной актуальностью данной проблематики, отсутствием эффективных и доступных средств медикаментозной коррекции, а также наличием данных, предполагающих корреляцию наблюдаемых у собак и кошек поведенческих аномалий с серотонином [11, 12, 15], модулятором которого является тразодон [4].В отсутствие ветеринарных тразодон-содержащих лекарственных средств мелким домашним животным назначают рецептурные медицинские препараты, которые неудобны для дозирования (у кошек), имеют существенные недостатки, связанные с переносимостью, и часто оказывают побочное действие ‒ избыточный седативный эффект, вызывают вялость, апатию, сонливость и угнетение [8…10], продолжающиеся в течение 10…12 часов после однократного применения, а в отдельных случаях более суток [14]. Приведенные выше состояния, нарушающие нормальный ритм жизни питомца и его владельца, являются крайне нежелательными и опасными. Таким образом, становится очевидной причина, по которой за последние 50 лет в мире не было разработано коммерческих препаратов на основе гидрохлорида тразодона, лицензированных для применения животным-компаньонам.Учитывая высокую актуальность проблематики поведенческих отклонений у собак и кошек, а также отсутствие эффективных и безопасных средств их фармакологической модификации, специалистами ООО НПК «СКиФФ» (Москва) разработан не имеющий аналогов на мировом ветеринарном рынке препарат для ситуационной коррекции девиантного поведения у животных-компаньонов ‒ Экспресс Успокоин® таблетки, содержащие в качестве активного фармацевтического ингредиента сукцината тразодона [5]. Использование сукцината тразодона в оптимальной дозе благодаря синергизму уникальных свойств соли янтарной кислоты и целевого действия тразодона обеспечило отсутствие побочных эффектов, характерных для медицинских препаратов на основе тразодона гидрохлорида, альтернативы которым до недавнего времени не было [1].Технология создания новых фармакологических препаратов включает в себя обязательные многоплановые токсикологические исследования. В их программу, в частности, входит определение токсических доз и переносимости препарата модельными животными, выявление наиболее чувствительных к препарату органов и систем, характера и степени патологических изменений в них, а также обратимости вызываемых повреждений.Цель исследованияИсследовать токсикологические параметры нового ветеринарного препарата Экспресс Успокоин® таблетки на лабораторных животных.Материалы и методыТоксикологическую оценку препарата Экспресс Успокоин® таблетки на лабораторных животных проводили в условиях вивария ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный аграрный университет» в соответствии с Приказом Министерства сельского хозяйства РФ [6], Руководством по проведению доклинических исследований новых фармакологических веществ и лекарственных средств [7] и ГОСТ 12.1.007-76 [3].В опытах использовали модификацию препарата для собак средних и крупных пород, содержащую 120 мг сукцината тразодона и вспомогательные вещества.Определение острой пероральной токсичности. Для проведения опыта было сформировано 6 групп (5 опытных и контрольная) беспородных белых мышей и 6 групп (5 опытных и контрольная) беспородных белых крыс, по 10 голов в каждой. Препарат после суспендирования в 1%-м крахмальном геле вводили с помощью внутрижелудочного зонда в дозах 400, 800, 1600, 2000, 3000 мг/кг мышам и 1000, 2000, 3000, 4000, 4500 мг/кг крысам.Период наблюдения за общим состоянием, поведением, приемом корма и воды, проявлением симптомов интоксикации, возможной гибелью лабораторных животных составлял 14 суток. По результатам наблюдений рассчитали среднюю смертельную дозу (LD50) препарата методом пробит-анализа по Литчфилду и Уилкоксону.Определение хронической токсичности. В опыте использовали 40 белых крыс, случайным образом разделенных на 3 опытных и 1 контрольную группы по 10 голов в каждой. Препарат вводили внутрижелудочно в дозах 1/10 LD50, 1/20 LD50 и 1/50 LD50 ежедневно, в течение 90 суток. Необходимое количество препарата суспендировали в 1%-м крахмальном геле.В ходе исследования наблюдали за общим состоянием и поведением животных, реакцией на раздражители (звук, свет), проявлением симптомов интоксикации, возможной гибелью.Через сутки после последнего введения препарата (91-е сутки от начала эксперимента) 5 животных из каждой группы подвергли эвтаназии и провели морфологическое и биохимическое исследование крови, патологоанатомическое вскрытие с макроскопическим описанием органов и тканей и определением массовых коэффициентов органов (печень, сердце, селезенка, легкие, почки).Через 10 суток после последнего введения препарата (101-е сутки эксперимента) подвергли эвтаназии оставшихся в каждой группе крыс и провели аналогичные исследования для выявления обратимости процессов после хронического внутрижелудочного введения препарата. Статистическую обработку проводили по Стьюденту-Фишеру с использованием t-критерия.Определение аллергизирующих свойств. Эксперимент проводили на 40 морских свинках, из которых были сформированы 3 опытных и 1 контрольная группы, по 10 животных в каждой.Сначала в течение 30 дней проводили сенсибилизацию подопытных животных путем перорального введения 1%-й крахмальной суспензии препарата, содержащей в 1 мл 120 мг сукцината тразодона, в дозе 6 мг/голову. На 10-й, 15-й и 30-й день от начала сенсибилизации тестировали сенсибилизирующие свойства с помощью конъюнктивальной и назальной проб, а также НРДТК.Для постановки конъюнктивальной пробы 1 каплю раствора препарата в дистиллированной воде (в соотношении 1:10) вводили глазной пипеткой с вытянутым тонким концом под верхнее веко морской свинке, во второй глаз (контрольный) инстиллировали 1 каплю дистиллированной воды.Реакцию на введение препарата определяли через 15 мин (быстрая реакция) и через 24 часа (гиперчувствительность замедленного типа) и оценивали по следующей шкале (в баллах):1 ‒ легкое покраснение слезного протока;2 ‒ покраснение слезного протока и склеры в направлении к роговице;3 ‒ покраснение всей конъюнктивы и склеры.При выполнении назальной пробы в одну половину носа закапывали 2 капли раствора препарата в дистиллированной воде (в соотношении 1:10). Если через 10…20 мин после введения появлялись затрудненное дыхание, чихание, водянистые выделения, пробу считали положительной.Для проведения НРДТК сначала получали перитонеальные тучные клетки крыс. Для этого животному после эвтаназии вводили внутрибрюшинно 5 мл подогретого до37 ºC физиологического раствора и после легкого массажа брюшной стенки в течение 1…2 мин производили разрез до средней линии, затем переворачивали тушку разрезом вниз и собирали смыв, стекающий с петель кишечника в смоченную гепарином пробирку. Препараты готовили на обезжиренных предметных стеклах, окрашенных 0,3%-м спиртовым раствором нейтрального красного и высушенных при комнатной температуре, следующим образом: к 0,03 мл взвеси тучных клеток добавляли 0,03 мл сыворотки подопытного животного и 0,03 мл исследуемой лекарственной формы, покрывали покровным стеклом, края которого смазывали вазелином, затем инкубировали 15 мин в термостате при 37 ºC и исследовали под микроскопом при ×20. Результаты оценивали методом подсчета процента дегранулированных тучных клеток. Положительным считается тест, если процент дегранулированных клеток превышает 10.Результаты и обсуждениеОстрая пероральная токсичность. Среднесмертельная доза препарата для белых мышей и крыс при внутрижелудочном введении составила 1900 и 3400 мг/кг, соответственно (табл. 1). На основании полученных данных был сделан вывод, что препарат Экспресс Успокоин® таблетки в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 относится к III классу опасности – «Вещества умеренно опасные».1.     Параметры острой пероральной токсичности препарата для мышей и крыс, мг/кгParameters of acute oral toxicity of the drug for mice and rats, mg/kgВид животныхМПДLD16LD50LD84LD100SLD50Мыши4009001900(1691,0…2109)25203330±209,0Крысы100019003400(3103,2…3696,8)42005350±296,8 Хроническая пероральная токсичность. Длительное применение препарата во всех испытанных дозах не вызывало значимых изменений в клиническом состоянии белых крыс. Случаев летального исхода среди животных в ходе опыта не зарегистрировано; за период наблюдения у крыс, находящихся в опыте, не было выявлено расстройств пищеварения и мочеотделения. Поведенческие реакции, поедание корма и потребление воды, частота дыхания у всех животных опытных групп оставались в пределах нормы и не отличались от контроля. Животные охотно поедали корм, равномерно прибавляли в массе тела, при этом достоверных различий между подопытными и контрольными животными по показателю прироста массы тела не отмечено. Не выявлено также зависимости массы тела от дозы препарата (табл. 2). 1.     Динамика прироста массы тела в течение 90-дневного применения препарата2.         Dynamics of body weight gain during the 90-day use of the drugПорядковый номер животногоМасса тела, гКонтрольная группаОпытные группы, доза сукцината тразодона, мг/кг340170680-е сутки1170,8172,2170,4173,22175,3173,4175,3170,13175,1175,5173,7175,64173,3173,1173,5171,05176,6173,8173,3170,36175,4172,3174,1173,57172,8172,1174,3173,98172,1174,3170,5172,19175,1173,1175,1174,210174,3173,7172,6174,6Среднее значение по группам174,08±1,78173,35±0,05173,28±1,69172,85±1,8830-е сутки1180,1181,1179,5183,12184,4181,6187,8183,63184,3185,2186,2184,34183,7184,8183,1180,25184,0184,0182,6182,96186,1183,2183,8184,67184,5182,5183,3183,18183,3186,7180,1184,09186,0182,3186,0186,210185,5185,8183,5185,3Среднее значение по группам184,19±1,71183,72±1,87183,59±2,59183,73±1,6245-е сутки1182,2182,2182,6184,42185,5182,4188,7184,83185,1186,3187,2185,54184,2185,7185,4183,55185,5185,3183,4184,96187,2184,2184,3186,87185,2183,7183,6186,68184,1187,8184,4182,39186,1183,2187,6188,410186,2186,1184,6189,5Среднее значение по группам185,13± 1,36184,69±1,32185,18±1,44185,67±1,5760-е сутки1185,1185,1184,0187,62189,3185,3191,3188,13189,6188,6190,1187,44187,2188,0186,5185,95188,8188,7186,1186,06189,1187,4187,9187,37188,0187,2187,5187,18189,3190,3185,9188,49189,4186,0190,0190,710189,2189,1188,3189,0Среднее значение по группам188,50±1,40187,57±1,70187,76±2,24187,75±1,4175-е сутки1187,4186,2186,5189,62191,5187,5192,4189,13191,3190,3192,1190,44189,7190,4188,4186,95189,2190,2187,1186,06192,3189,3189,7187,37190,2189,7188,3188,18191,6191,4187,7187,49191,3189,3192,6191,710192,1192,3190,2190,0Среднее значение по группам190,66±1,09189,66±1,27189,5±1,62188,65±1,2990-е сутки1189,1189,3188,1191,12192,3189,2195,4192,33193,7192,7194,3191,64196,2192,4190,0189,35192,7191,0190,5190,56192,8191,1191,1191,77192,0190,2191,8191,28193,2195,6189,5192,39193,1190,4195,3195,010193,5194,3192,0194,1Среднее значение по группам192,86±1,75191,62±2,11191,08±2,49191,91±1,65 При оценке влияния препарата на функциональное состояние центральной нервной системы было отмечено, что крысы сохраняли двигательную активность, сопоставимую с активностью контрольных животных, адекватно реагировали на внешние раздражители.Результаты анализа периферической крови крыс через 1 день и через 10 дней после 90-дневного введения препарата показали, что количество эритроцитов, лейкоцитов и лейкограмма в испытуемом диапазоне доз существенно не изменялись во времени и флюктуировали в пределах контрольных величин (табл. 3, 4). Все незначительные изменения, обнаруженные в гематологической картине подопытных крыс, находились в референтном диапазоне.3. Гематологические показатели через сутки после последнего введения препаратаHematological parameters one day after the last administration of the drugПоказателиСредние по группе значения показателейКонтрольная группаОпытные группы, доза сукцината тразодона, мг/кг34017068RBC, •1012/л7,42±0,197,65±0,257,54±0,107,45±0,17MCV, мкм353,2±0,7854,9±0,6953,4±0,4453,8±0,43MCH, пг18,7±0,4118,6±0,4118,6±0,2318,7±0,26MCHC, г/дл34,3±0,3034,3±0,6734,9±0,2934,5±0,22HGB, г/л131,4±2,22129,7±5,11129,3±1,80128,5±1,79HCT, %43,8±0,5941,6±1,4541,9±0,5241,8±0,45PLT, •109/л610,5±13,4619,4±23,3598,5±25,7611,7±24,8WBC, •109/л7,04±0,316,98±0,277,13±0,357,21±0,21ЛейкограммаНейтрофилы, %:юныепалочкоядерныесегментоядерные00,35±0,0515,3±1,6700,33±0,0414,8±0,6800,33±0,0315,9±1,4800,26±0,0514,3±1,46 Базофилы, %0000       Эозинофилы, %2,31±0,282,45±0,312,46±0,312,30±0,43 Моноциты, %2,38±0,312,43±0,262,57±0,432,37±0,37 Лимфоциты, %79,5±1,7380,8±1,4779,1±1,5680,0±1,5  4.     Гематологические показатели через 10 суток после последнего введения препаратаHematological parameters 10 days after the last administration of the drugПоказателиСредние по группе значения показателейКонтрольная группаОпытные группы, доза сукцината тразодона, мг/кг34017068RBC, •1012/л7,92±0,167,61±0,217,54±0,347,73±0,45MCV, мкм353,3±1,1452,6±1,0752,7±0,4752,5±0,68MCH, пг17,4±0,4717,8±0,3517,5±0,5817,5±0,42MCHC, г/дл32,7±0,3831,5±0,4931,5±0,5131,6±0,31HGB, г/л129,5±1,41128,3±1,33129,3±5,19129,1±1,89HCT, %40,5±0,3539,7±0,4140,9±0,7240,4±0,35PLT, •109/л631,5±14,7626,3±17,8616,3±25,7634,3±36,8WBC, •109/л7,25±0,237,39±0,57,15±0,316,95±0,21Лейкограмма Нейтрофилы, %:юныепалочкоядерныесегментоядерные  00,62±0,2914,6±0,76  00,50±0,1714,2±0,81  00,64±0,1414,4±1,08  00,53±0,1913,2±1,11Базофилы, %0000Эозинофилы, %3,31±0,213,45±0,363,15±0,543,32±0,25Моноциты, %2,66±0,372,75±0,382,95±0,692,91±0,37Лимфоциты, %81,5±1,0379,4±1,0179,3±2,0580,4±1,11 По результатам биохимического анализа крови у животных из опытных групп также не было отмечено достоверных изменений по сравнению с аналогичными показателями у контрольных животных (табл. 5). В частности, не зарегистрировано сколько-нибудь существенных сдвигов в значениях показателей, характеризующих протеинсинтезирующую функцию печени (концентрации общего белка и альбумина), углеводный (глюкоза) и жировой (общие липиды, холестерин) обмен. Активность обеих аминотрансфераз претерпевала незначительные колебания, которые, однако, находились в пределах референтного интервала, что подтверждает отсутствие активации процессов цитолиза гепатоцитов. На основании полученных данных был сделан вывод, что препарат в испытанном диапазоне доз не оказывает отрицательного воздействия на основные звенья метаболизма животных.Биохимические показатели крови через 1 и 10 суток после последнего применения препаратаBiochemical parameters of blood 1 and 10 days after the last use of the drugПоказателиСредние по группе значения показателейКонтрольная группаОпытные группы, доза сукцината тразодона,    мг/кг34017068Через 1 сутки после последнего введенияОбщий белок, г/л62,7±1,1961,2±1,1662,1±1,8962,3±1,29Белковые фракции, г/л:Альбумины Глобулины:- α- β- γ 37,0±1,07  8,92±0,317,34±0,388,91±0,74 36,8±1,05  8,84±0,297,28±0,348,63±0,87 37,1±2,21  8,28±0,157,46±0,488,62±0,65 36,6±1,21  8,34±0,357,43±,147,75±0,49АсАТ, Е/л128,3±15,1126,3±14,2119,3±10,2117,2±10,3АлАТ, Е/л35,4±2,9334,2±2,7636,1±1,7835,6±2,96ЩФ, Е/л86,0±4,1985,8±4,2492,1±6,1587,8±5,61Гамма ГТ, Е/л1,24±0,261,15±0,291,05±0,311,12±0,57Мочевина, мМ/л7,77±0,337,50±0,467,42±0,246,71±0,54Креатинин, мкМ/л34,3±1,3933,4±1,3034,1±1,0732,5±1,90Холестерин, мМ/л2,74±0,052,63±0,032,64±0,142,78±0,07Общие липиды, г/л1,94±0,091,96±0,091,93±0,111,94±0,04Глюкоза, мМ/л4,43±0,244,24±0,254,52±0,184,53±0,28Фосфор неорганический, мМ/л1,94±0,181,94±0,111,90±0,041,98±0,12Кальций, мМ/л2,81±0,172,73±0,172,87±0,172,81±0,26Через 10 суток после последнего введенияОбщий белок, г/л58,1±1,1458,1±2,1457,4±1,6158,4±2,41Белковые фракции, г/л:Альбумины Глобулины- α- β- γ 31,7±1,08  7,23±0,247,37±0,328,05±0,87 37,7±2,17  7,85±0,927,17±0,867,50±0,38 36,3±1,06  6,64±1,436,84±0,787,76±0,66 36,4±1,78  6,93±0,836,51±0,687,86±0,50АсАТ, Е/л138,3±12,4139,6±9,84127,8±11,2132,6±8,02АлАТ, Е/л35,4±2,6840,4±5,9240,2±3,9841,4±6,14ЩФ, Е/л109,8±4,51104,6±11,8110,4±7,95102,8±8,07Гамма ГТ, Е/л1,54±0,261,54±0,141,55±0,471,51±0,22Мочевина, мМ/л6,25±0,386,86±0,486,47±0,596,71±0,36Креатинин, мкМ/л37,3±1,4336,4±1,1637,6±2,2137,4±1,58Холестерин, мМ/л2,56±0,442,35±0,252,35±0,132,45±0,03Общие липиды, г/л2,33±0,312,17±0,122,06±0,252,14±0,14Глюкоза, мМ/л4,46±0,374,34±0,394,48±0,474,37±0,35Фосфор неорганический, мМ/л2,05±0,092,03±0,172,04±0,152,11±0,12Кальций, мМ/л2,56±0,122,44±0,232,52±0,182,37±0,33 По результатам макроскопического исследования органов животных опытных групп, проведенного после аутопсии, выполненной на 91-й и 101-й день эксперимента, различий в их состоянии и структуре у животных, длительно получавших препарат, и у крыс из контрольной группы обнаружено не было.Об отсутствии значимых нарушении в состоянии внутренних органов крыс после многократного применения им препарата свидетельствуют также и результаты морфометрического анализа (табл. 6). 5.     Масса внутренних органов крыс через 1 и 10 суток после завершения введения препаратаThe mass of the internal organs of rats 1 and 10 days after the completion of the drug administrationОрганМасса, гКонтрольная группаОпытные группы, доза сукцината тразодона (мг/кг)34017068Через 1 сутки после последнего введенияПечень24,8±0,4726,1±0,6826,0±0,7725,7±1,10Почки5,23±0,225,31±0,225,34±0,165,56±0,15Легкие3,61±0,153,76±0,153,81±0,143,48±0,28Селезенка2,10±0,212,09±0,332,17±0,232,22±0,13Сердце2,91±0,742,82±0,372,89±0,112,87±0,12Через 10 суток после последнего введенияПечень29,2±0,6629,4±1,3828,1±1,2529,5±1,83Почки6,12±0,126,02±0,485,88±0,375,78±0,38Легкие3,97±0,313,67±0,513,69±0,433,59±0,67Селезенка2,35±0,142,20±0,272,19±0,362,31±0,30Сердце3,44±0,272,14±0,252,50±0,283,10±0,24 Таким образом, 90-дневное внутрижелудочное применение препарата крысам в указанном интервале доз не оказывает негативного влияния на поведенческие реакции животных и их общий вид, на показатели крови и основные физиологические функции организма, на морфологические показатели органов и тканей, что подтверждает хорошую переносимость препарата животными.Аллергизирующие свойства. Результаты конъюнктивальной, назальной проб и НРДТК приведены далее.Конъюнктивальная проба. Реакция сенсибилизированных морских свинок не отличалась от реакции контрольных животных: глазная щель не сужалась, не было зарегистрировано изменений сосудистого рисунка конъюнктивы или ее покраснения. При оценке состояния конъюнктивы, роговицы и век подопытных животных установлено, что препарат не вызывает раздражения или каких-либо иных нежелательных эффектов как сразу после инстилляции, так и на протяжении всего опыта.Назальная проба. Закапывание сенсибилизированным и контрольным морским свинкам в носовые ходы исследуемого препарата на 10-е, 15-е и 30-е сутки не вызывало гиперемии слизистой оболочки, чихания и/или усиления секреции слизи. На основании этих данных тест оценили как отрицательный.Реакция непрямой дегрануляции тучных клеток. Результаты НРДТК представлены в таблице 7. С учетом того, что процент дегранулированных тучных клеток в опытных группах был менее 10 %, ответ, полученный в НРДТК, является отрицательным. 6.     Результаты реакции непрямой дегрануляции тучных клетокThe results of the reaction of indirect degranulation of mast cellsДлительность сенсибилизации, суткиДоля дегранулированных тучных клеток, %Опытная группаКонтрольная группа107,33±1,616,86±1,38156,81±1,957,69±1,19307,74±1,267,35±1,97 ЗаключениеСогласно результатам, полученным нами при исследовании острой токсичности препарата Экспресс Успокоин® таблетки его средне-смертельная пероральная доза при внутрижелудочном введении мышам и крысам составляет, соответственно, 1900 мг/кг и 3400 мг/кг, что позволяет определить новый препарат как относящийся к умеренно опасным для млекопитающих веществам (III класс опасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76).При изучении субхронической токсичности препарата на крысах установлено, что его применение в течение 90 суток в дозах 340 мг/кг, 170 мг/кг и 68 мг/кг, примерно в 10…50 раз превышающих терапевтическую, не вызывает сколько-нибудь значимых изменений в клиническом состоянии, а также в морфологической и биохимической картине крови подопытных крыс, которые в течение всего эксперимента соответствовали физиологическим нормам для данного вида животных. У получавших препарат животных не было обнаружено и патоморфологических изменений. По результатам проведенных после аутопсии макроскопического исследования и морфометрического анализа внутренних органов, их размер и состояние у подопытных и контрольных крыс не имели достоверных различий по определяемым параметрам. Таким образом, совокупность полученных экспериментальных данных однозначно подтверждает хорошую переносимость препарата Экспресс Успокоин® таблетки.В результате токсикологических исследований также установлено, что препарат не проявляет раздражающего и аллергизирующего действия на конъюнктиву глаза и слизистую оболочку носа при многократном применении и не вызывает дегрануляции тучных клеток крыс, выходящей за пределы нормы.Конфликт интересовПроизводителем препарата Экспресс Успокоин® таблетки и спонсором данного исследования является ООО «НПК «СКиФФ». Решение о публикации результатов научной работы принадлежит разработчику.