Сокращения: ВББ ― вирус болезни Борна, п.о. ― пара оснований, РНК ― рибонуклеиновая кислота, РНЧ ― рибонуклеочастица, ФИТЦ ― флуоресцеин-5-изотиоцианат, ЦНС ― центральная нервная система Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования России по государственному заданию № 0578-2014-0023. Авторы не имеют конфликта интересов. ВведениеВирус болезни Борна представляет собой несегментированный РНК-содержащий вирус, принадлежащий к семейству Bornaviridae [1]. Геном состоит из ~8900 п.о., это самый маленький из мононегавирусов, кодирующий только шесть белков (de la Torre, 1994): нуклеопротеин (N), вирусную полимеразу (L) и еt кофактор ― фосфопротеин (P), матриксный белок (M), гликопротеин (G) и неструктурный малый белок (X). Оболочечный вирион содержит РНЧ, состоящую из вирусной геномной РНК, инкапсулированной в белки N, L, P и M. Оболочка состоит из мембраны, в которой обнаружены две изоформы вирусного белка G (84 и 43 кДа) [10].In vivo ВББ преимущественно поражает нейроны ЦНС, но in vitro может инфицировать клетки разных типов [8]. Он имеет особенность, уникальную для большинства мононегавирусов ― репликацию в инфицированных клетках без проявления цитопатического эффекта. Несмотря на многочисленные исследования, некоторые этапы цикла репликации борнавируса остаются неизвестными. После взаимодействия с еще неизвестным рецептором BББ проникает в клетку путем клатрин-зависимого эндоцитоза с образованием пузырька, который сливается с ранней эндосомой. Затем подкисление поздней эндосомы обеспечивает слияние между вирусной и эндосомальной мембранами и высвобождение РНЧ [7]. После репликации генома и синтеза белка точные условия сборки вириона до сих пор остаются неизвестными. В частности, неизвестно, следуют ли РНЧ по антероградному и ретроградному транспортному маршруту в оболочке или без нее [6]. Транспорт на большие расстояния по аксональному маршруту является необходимостью цикла репликации, поскольку сайты входа и выхода часто удалены от клеточной сомы.Аксональный транспорт является ключевым механизмом для нейроинвазивных патогенов [15]. Действительно, большие расстояния, отделяющие сому клетки от нервных окончаний, подразумевают, что нейротропные вирусы должны использовать специализированные молекулярные двигатели для векторного перемещения вдоль аксонов, то есть они не могут полагаться исключительно на пассивную диффузию. Для патогенов описаны две основные стратегии ретроградного транспорта по аксонам [13].Первый из них заключается в прямом наборе молекулярных моторов, таких как цитоплазматический динеин или связанный с ним комплекс динактин, как показано на примере вируса простого герпеса типа 1. После слияния мембран белки матрикса и тегумент вируса простого герпеса типа 1 высвобождаются в цитоплазму. Несколько вирусных белков затем рекрутируют динеин, динактин и адаптерные белки, обеспечивая быстрый ретроградный транспорт вдоль микротрубочек [9].Другой стратегией для передачи патогенов через аксоны является использование везикулярного транспорта. Мембранные органеллы, такие как эндоцитарные и экзоцитарные везикулы, постоянно перемещаются вдоль аксонов, и некоторые патогены могут получить доступ к этим органеллам для распространения в ЦНС [12]. Например, это относится к аденовирусу собак типа 2, который проникает в клетку с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза и затем проникает в аксональные эндосомы [13]. Эти эндоцитарные структуры, также называемые «сигнальными эндосомами», обычно ответственны за транспорт нейротрофинов, таких как фактор роста нервов или нейротрофический фактор мозга, а также их соответствующие рецепторы p75NTR и TrkB [4, 5]. Важной характеристикой этих везикул является то, что рН их содержимого близок к нейтральному [3]. Это позволяет переносить содержимое на большие расстояния в защитной среде, избегая зависящих от рН конформационных изменений. Нейтральные аксональные эндосомы могут, следовательно, представлять собой идеальный транспортный путь для нейротропных вирусов, чтобы достичь клеточной сомы без дестабилизации вирусной частицы, предотвращая слияние мембран и преждевременное высвобождение вирусного генома [14].Несмотря на многочисленные исследования, некоторые этапы цикла репликации борнавируса остаются мало изученными, в частности, рецептор-опосредованное проникновение, ретроградный транспорт в ядро, сборка и высвобождение вириона [11]. Цель исследованияПроследить с помощью иммуноферментного и иммуногистохимического метода распределение основного белка ВББ ― фосфопротеина Р (р24) в клетках головного мозга естественно-восприимчивых животных, сопоставить данные с результатами опытов по репликации борнавируса, выполненных преимущественно на экспериментальных моделях. Материалы и методыИсследование проводили по теме НИР 0578-2014-0023. Финансовая поддержка работы обеспечена Министерством науки и высшего образования России. Работу выполняли в лаборатории вирусологии ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.Гистологические препараты были приготовлены из головного мозга лошадей и овец с признаками энцефаломиелита после их эвтаназии. Ткани фиксировали в 10%-м нейтральном формалине, обезжиривали в спиртах, заливали в парафиновые блоки, из которых готовили срезы толщиной 5…7 микрон. Парафин удаляли в трех сменах ксилола, по 2 мин в каждой смене и трех сменах этилового спирта в концентрации 96 %, 96 % и 70 %. соответственно, по 2 мин в каждой смене. Срезы промывали охлажденным фосфатно-солевым буферным раствором (137 мM NaCl; 2,7 мM KCl; 10 мM Na2HPO4; 2 мM K2HPO4; pH 7,2). Для постановки реакции иммунофлуоресценции и иммуногистохимического метода использовали непрямой вариант. Применяли моноспецифическую поливалентную сыворотку кролика против фосфопротеина Р вируса болезни Борна (р24) [2]. В качестве антивидового конъюгата использовали аффинно очищенные антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с ФИТЦ или пероксидазой хрена. Инкубацию проводили во влажной камере при температуре 37 ºС в течение 45 мин. После каждого этапа срезы промывали фосфатно-солевым буферным раствором 3…4 раза. Для постановки реакции флуоресценции готовили препараты для исследования под люминесцентном микроскопом с нефлуоресцирующим иммерсионным маслом. Для иммуногистохимического метода использовали субстратный раствор на основе хромогена ― 3, 3’диаминобензидина. Реакцию учитывали с помощью светового микроскопа. Результаты и обсуждениеОбъектом нашего исследования служили пробы головного мозга больных лошадей и овец, полученные в период вспышки или спорадических случаев заболевания от животных с неврологическим синдромом. При микроскопии обработанных специфической сывороткой против р24 ВББ гистологических срезов тканей головного мозга лошадей и овец в световом или люминесцентном микроскопе наблюдали весьма сходную специфическую окраску или флуоресценцию клеток головного мозга, что подтверждало единую природу заболевания. На рисунках 1…4 представлены элементы структуры клеток головного мозга лошадей и овец, выявленные посредством специфической окраски гистосрезов методом иммунофлуоресценции или иммуногистохмическим методом:ü мелкие гранулы, «алмазный блеск»;ü диффузная флуоресценция цитоплазмы и крупные гранулы, которые концентрируются в цитоплазме нейрона. Очевидно, что в этом случае мы наблюдаем агрегацию эндосом, связанную с их транспортировкой по аксонам нейрона. Специфически окрашенные гранулы в виде бусин, демонстрирующие транспорт вирусного материала по аксону;ü антиген р24 ВББ (обнаруженный иммуногистохимическим методом);ü межклеточный транспорт вируса через цитоплазматические мостики.Известна работа, характеризующая флуоресцирующие включения BББ у птиц, свидетельствующие о наличии вирусного антигена р24, которые авторы описывают как «алмазный блеск», «изумрудная зернистость» [11]. Подобные включения мы наблюдали в клетках и межклеточном пространстве головного мозга овец и лошадей, но в меньшем количестве, что может быть обусловлено характером течения инфекционного процесса. Известно, что ВББ in vivo преимущественно поражает нейроны ЦНС, но in vitro может инфицировать клетки разных типов [8]. Он имеет особенность, уникальную среди мононегавирусов, репликацию в ядре инфицированных клеток без проявления цитопатического эффекта.   Рис. 1. Флуоресцирующие включения BББ, которые описываются как «алмазный блеск», «изумрудная зернистость» ― свидетельство наличия вируспецифического антигена р24 (метод окраски - непрямая иммунофлуоресценция)Fig. 1. Fluorescent inclusions BDV, which are described as «diamond brilliance», «emerald granularity» ― evidence of virus-specific antigen p24 (method of staining – indirect immunofluorescence) Рис. 2. Специфическая флуоресценция в цитоплазме и аксоне головного мозга лошади, агрегация гранул в участке клетки у основания аксонаFig. 2. Specific fluorescence in cytoplasm and the axon of the horse’s brain, aggregation of granules in the area of the cell base of the axon           В наших опытах специфическое окрашивание клеточных элементов головного мозга отмечали при естественной борнавирусной инфекции в аксонах нейронов больной лошади (рис. 2). В связи с этим возникает вопрос: зафиксированный момент представляет собой антероградный или ретроградный транспорт РНК вируса болезни Борна? Специфическое окрашивание мелких частиц можно видеть в аксоне в виде бусин, которые в свою очередь имеют гранулированную структуру. Положительная реакция имунофлуоресценции объясняется наличием в гранулах вирусспецифического белка р24, который является одним из компонентов РНЧ ВББ и в данном случае служит маркером, который позволяет (посредством реакции иммунофлуоресценции и гистоиммунологического теста) проследить топографию РНЧ ВББ. Конгломерат таких же гранул наблюдается в цитоплазме нейрона, в участке, находящемся в основании аксона. На том же снимке видно, что ядро нейрона остается темным, что указывает на отсутствие белка р24. Принимая во внимание полученные нами результаты и сопоставив их с данными некоторых авторов, можно считать, что на снимке зафиксирован ретроградный транспорт вируса болезни Борна. Рис. 3 Результаты иммуногистохимического теста в срезах головного мозга лошади (фото a, b)Fig. 3. Results of immunohistochemical test in sections of the brain of a horse (photo a, b) a b   Рис. 4. Культура клеток Vero, межклеточный транспорт вирусного материала посредствам «цитоплазматических мостиков»Fig. 4. Vero cell culture, intercellular transport of viral material through «cytoplasmic bridges» В опытах in vitro показано, что траспорт вирусного материала, помимо длительного аксонального пути, возможен существенно более коротким маршрутом ― через «цитоплазматические мостики». На рисунке 4 видно проникновение эндосом  в соседнюю клетку посредствам  такого мостика. В цитоплазме исходной клетки сохраняются темные вакуоли. ЗаключениеТаким образом, результаты, полученные нами при исследовании срезов головного мозга лошадей и овец ― естественно-восприимчивых к болезни Борна животных, совпадают с выводами ряда авторов о существенной роли аксонального транспорта ВББ в нейропатогенезе инфекции. Эти данные позволяют обосновать эффективный для ВББ механизм проникновения вирусной частицы в нейрон. В экспериментах in vitro с культурой клеток Vero отмечено, что возможен также способ распространения вируса посредством образования «цитоплазматических мостиков», вследствие чего вирусные частицы избегают преждевременной инактивации в цитоплазме. Представленные результаты позволят лучше понять некоторые вопросы нейропатогенеза болезни Борна и усовершенствовать лабораторную диагностику болезни.