Сокращения: АМОЛ ― ацетат мепрегенола, БАК ― биохимический анализ крови, ГКП ― гормональные контрацептивные препараты, ДВ ― действующее вещество, ИФА ― иммуноферментный анализ, ЛГ ― лютеинизирующий гормон, МДЖ ― мелкие домашние животные, ОАК ― общеклинический анализ крови, УЗИ ― ультразвуковое исследование

Введение

Коррекция половой функции домашних животных, в частности кошек и собак, сегодня остается важной ветеринарной проблемой. Одна из основных практических задач в рамках исследований по регуляции половой функции у животных, содержащихся в домашних условиях, ― это подавление проявлений половой охоты, которые доставляют немало хлопот их хозяевам. Существует два альтернативных подхода к решению этой задачи: хирургический (кастрация) и консервативный, предусматривающий применение ГКП. Каждый из этих методов контрацепции МДЖ имеет в ветеринарном сообществе как сторонников, так и противников. При этом в качестве основных недостатков оперативного способа контрацепции отмечают необратимый результат хирургического вмешательства, его инвазивный характер, определенный риск летального исхода и осложнений в послеоперационный период, в том числе развитие синдрома реминантного яичника [1, 2]. Основные претензии противников консервативного направления контрацепции с применением ГКП, представленных преимущественно гестаген-содержащими препаратами, относятся к возможным последствиям сдвига гормонального статуса, выражающимся в возникновении характерных для некоторых гестагенов побочных эффектов [3].

В связи с этим следует отметить, что доводы современных оппонентов применения ГКП для коррекции половой функции МДЖ основываются, главным образом, на устаревших сведениях, относящихся к практике использования в ветеринарии моногормональных препаратов этого типа. Моногормональные контрацептивные средства применяют в мировой ветеринарной практике более 50 лет. В качестве ДВ в них долгое время использовали, главным образом, синтетические модификации природного гормона прогестерона ― мегестрола ацетат и медроксипрогестерона ацетат [4]. При этом общим недостатком обоих указанных соединений, неоднократно подвергавшихся критике со стороны специалистов, является необходимость использования больших доз гестагена, в которых он небезопасен для организма животного из-за возможности возникновения побочных эффектов, в том числе комплекса кистозной гиперплазии эндометрия и пиометры [5], опухоли молочной железы [6, 7].

В связи с этим, одной из основных задач специалистов, работающих в области контрацепции, в последние годы был поиск возможности снижения доз гестагена в составе ГКП. Эту проблему успешно разрешили отечественные исследователи. Так, в результате поиска новых ДВ для гестаген-содержащих ГКП, усилиями отечественных специалистов были синтезированы и введены в ветеринарную практику такие синтетические аналоги прогестерона, как АМОЛ и его сложные эфиры [8…10], которые, обладая высокой активностью, могли использоваться в значительно меньших дозах, чем их предшественники. Однако наиболее существенным шагом вперед в решении вопросов, связанных с повышением эффективности и безопасности ГКП для регуляции половой охоты у МДЖ, стало предложение применять для этой цели бигормональные композиции, где гестаген представлен в комбинации с эстрогеном. Прототипом для создания ветеринарных препаратов этого типа послужили некоторые медицинские аналоги, назначаемые для гормональной контрацепции у женщин [11…12], в которых сочетание гестагена и эстрогена позволило в десятки раз снизить терапевтическую дозировку гестагена без потери эффективности.

В течение последних 20 лет отечественными специалистами предложено множество гестаген-эстрогенных композиций для регуляции половой охоты у МДЖ [13…18] и др., в основу создания которых заложена идея приблизить компонентный состав двух важнейших половых гормонов к природному, обеспечив тем самым более мягкое воздействие с минимальным риском развития побочных реакций. Практическим результатом этих исследований стала разработка целого ряда ветеринарных препаратов, не имеющих аналогов в мире. В настоящее время на территории России зарегистрированы и разрешены к применению в ветеринарной практике оральные бигормональные средства для кошек и собак на основе комбинации сложного эфира АМОЛа и этинилэстрадиола: таблетки и капли СЕКС БАРЬЕР (ООО «НПК «СКиФФ»), содержащие мепрегенола ацетат водорастворимый; капли и таблетки «Гестренол», содержащие пропионат мепрегенола, таблетки и капли КонтрСекс Neo, содержащие ацетобумедон (ООО «НВП «Астрафарм») в качестве гестагенного компонента [19].

Цель работы

С учетом неоднозначного отношения ветеринарного сообщества к применению ГКП, с одной стороны, и возможности применить новые знания и современные подходы при решении этого вопроса, с другой, представлялось целесообразным провести всестороннее экспериментальное исследование влияния бигормонального контрацептивного средства на организм животного при разных схемах использования в условиях длительного применения, что и стало целью настоящей работы.

Материалы и методы

Препарат. В качестве испытуемого фармакосредства был использован препарат СЕКС БАРЬЕР (капли для кошек), содержащий в качестве ДВ мепрегенола ацетат водорастворимый и этинилэстрадиол, который постоянно применяли животным в течение 2-х лет в соответствии с Инструкцией [20].

Активными фармакологическими ингредиентами препарата СЕКС БАРЬЕР являются мепрегенола ацетат водорастворимый и этинилэстрадиол (в соотношении 100 : 1); в 1 мл препарата содержится 1 мг мепрегенола ацетата водорастворимого и 0,01 мг этинилэстрадиола. По степени воздействия на организм препарат относится к малоопасным веществам (IV класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76) [20].

Критерии включения животных и условия их содержания. Влияние на организм кошек бигормонального контрацептивного препарата СЕКС БАРЬЕР было изучено в период с мая 2016 по ноябрь 2018 года в условиях стационара ветеринарной клиники «БИО-ВЕТ» (г. Москва) под руководством, доктора ветеринарных наук Е.Е. Беловой.

В эксперимент включили 10 клинически здоровых, вакцинированных от инфекционных болезней беспородных кошек в возрасте от 1 до 2 лет, массой тела 2,8…3,2 кг, проявляющих половую цикличность. Животные были взяты из приюта для бездомных животных Московской области.

Все кошки до начала эксперимента прошли клиническое исследование, которое включало в себя осмотр, определение частоты дыхательных движений, сердечных сокращений, термометрию. Врач регистрировал породу, массу тела, упитанность животного, состояние его кожи и шерстного покрова, ушных раковин, зубов и слизистой оболочки ротовой полости; проводил осмотр наружных половых органов, выполнял пальпацию печени и молочных желез. Полученные данные были занесены в индивидуальные регистрационные карты. До начала эксперимента всех животных обработали от эктопаразитов и гельминтов, после чего они в течение 1…3-х месяцев (по мере включения в исследование) находились на карантине.

Карантин и последующий эксперимент проходили в условиях стационара с искусственным освещением в течение не менее 10 ч в сутки и контролируемым микроклиматом. Животные содержались в индивидуальных клетках размером 91 х 57 х 78 см. Кормление ― 2 раза в день полнорационным промышленным рационом Hill's Science Plan™ Feline Adult Indoor Cat Chicken в соответствии с рекомендациями производителя. Поение ― ad libitum водопроводной водой.

Все животные были разделены на две группы: опытную и контрольную, по 5 особей в каждой. Для формирования максимально однородных групп при распределении животных учитывали массу тела, возраст и тип конституции.

Дизайн эксперимента, комплекс исследуемых показателей и периодичность их оценки. Исследование включало в себя 2 этапа.

Этап 1 исследования. В период карантинирования у кошек обеих групп проявлялись признаки половой охоты. В соответствии с планом эксперимента животным опытной группы в первый день половой охоты начинали давать препарат «СЕКС БАРЬЕР» по схеме для прерывания течки в соответствии с Инструкцией (4 капли один раз в день, в течение 3…5 дней). Кошки контрольной группы в течение 5 дней с момента начала половой охоты получали растворитель для препарата «СЕКС БАРЬЕР» (оливковое масло) в тех же дозах, что и подопытные животные. Через 10 дней после исчезновения признаков половой охоты кошек опытной группы переводили на схему применения препарата для задержки течки (4 капли один раз в 14 дней), которую использовали в течение 12 месяцев. Кошкам контрольной группы по той же схеме вводили оливковое масло.

Чтобы оценить сроки восстановления половой цикличности, через 12 месяцев непрерывного применения капель СЕКС БАРЬЕР для задержки течки кошкам опытной группы препарат отменили. Одновременно кошки контрольной группы перестали получать растворитель для препарата СЕКС БАРЬЕР.

На фоне отмены препарата у животных опытной группы достаточно синхронно, по истечении примерно 4 недель (с незначительной индивидуальной разницей во времени), восстановился половой цикл, что выразилось в появлении признаков эстрального поведения.

Этап 2 исследования. После восстановления полового цикла кошкам опытной группы возобновили введение препарата СЕКС БАРЬЕР по схеме, применявшейся в первой части эксперимента: сначала однократно для прерывания течки, а через 10 дней после исчезновения признаков половой охоты ― по схеме для предотвращения течки в течение 12 месяцев. Кошки контрольной группы с началом у них течки, как и ранее, получали оливковое масло в соответствии с описанными выше схемами.

Для оценки влияния длительного применения бигормонального контрацептивного препарата СЕКС БАРЬЕР на физиологические системы организма каждые два месяца в течение эксперимента оценивали состояние кожи и шерстного покрова животного, ушных раковин, зубов и слизистой оболочки ротовой полости, проводили осмотр наружных половых органов, пальпацию печени и молочных желез, термометрию; определяли частоту дыхательных движений, сердечных сокращений. Кроме того, брали кровь для ОАК и БАК, а также определения содержания в плазме эстрадиола и прогестерона; выполняли цитологическое исследование вагинальных мазков; УЗИ матки и яичников. Общая схема исследования приведена в таблицах 1 и 2.

1.    Схема эксперимента по изучению влияния бигормонального контрацептивного препарата СЕКС БАРЬЕР на организм кошек, этап 1

1. Design of an experiment to study the effect of the bi-hormonal contraceptive drug SEX BARRIER on the cats, stage 1

Примечание. * ― в эти месяцы эксперимента выполняли мониторинг состояния кошек, который включал в себя осмотр, ОАК, БАК; оценку содержания в крови эстрадиола, прогестерона; УЗИ; цитологический анализ мазка

2. Схема эксперимента по изучению влияния бигормонального контрацептивного препарата СЕКС БАРЬЕР на организм кошек, этап 2

2. Design of an experiment to study the effect of the bi-hormonal contraceptive drug SEX BARRIER on the cats, stage 2

Примечание. * ― в эти месяцы эксперимента выполняли мониторинг состояния кошек, который включал в себя осмотр,; оценку содержания в крови эстрадиола, прогестерона; УЗИ; цитологический анализ мазка

** ― ОАК, БАК.

Анализы крови. ОАК и БАК кошек опытной и контрольной групп проводили в лаборатории ветеринарной клиники «БИО-ВЕТ». Для ОАК кровь брали из вены утром, до кормления, в вакуумную пробирку с К3-ЭДТА в количестве 1,0…1,5 мл и исследовали на автоматическом гематологическом анализаторе «HESKA Element HT5» (США) с применением реактивов «HESKA» (США). Определяли следующие показатели: гематокрит, гемоглобин, эритроциты, лейкоциты, тромбоциты.

Кровь для БАК брали из вены утром, до кормления, в вакуумную пробирку с активатором свертывания в количестве 1,5…2 мл. Сыворотку отделяли на лабораторной центрифуге «ЦЛМН-Р10-01-Элекон-М» (Россия) при 2700 мин^-1 в течение 3…5 минут и затем исследовали на автоматическом биохимическом анализаторе «Super Z» (Китай) с применением реактивов «Randox Laboratories» (Великобритания). Определяли следующие аналиты: общий белок, мочевину, креатинин, холестерин, триглицериды, глюкозу.

Содержание  эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови определяли в ветеринарном лабораторно-диагностическом центре «Неовет» (г. Москва) методом ИФА в полуавтоматическом режиме с помощью наборов для ИФА (ООО «Хема Медика», Россия).

Цитологический анализ и УЗИ. Вагинальные мазки брали с помощью увлажненного физиологическим раствором урогенитального зонда. Мазки подвергали цитологическому анализу после их окрашивания с помощью набора «Лейкодиф 200» (LDF 200), (Erba Lachema, Чехия).

Для УЗИ матки и яичников в 3D-режиме использовали ветеринарный ультразвуковой сканер «Cymedica» (Китай) с линейным датчиком 5 МГц. В ходе исследования оценивали размеры яичников и тела матки, а также их структуру. Полученные данные были статистически обработаны с помощью программного обеспечения BioStat 3.03.

Результаты и обсуждение

Клинический осмотр. В течение всего периода проведения эксперимента при физикальном и инструментальном исследовании у животных опытной и контрольной группы не было зарегистрировано никаких отклонений от показателей физиологической нормы.

Масса тела при включении в эксперимент (июнь 2016 г.) находилась в пределах 2,8…3,2 кг. По результатам второго клинического исследования (август 2016 г.) масса тела животных в обеих группах несколько увеличилась по сравнению с исходной и составляла в среднем 2,9…3,8 кг, что с высокой степенью вероятности объясняется вынужденной гиподинамией.

Наблюдение за поведенческими признаками половой охоты. Кошки контрольной группы в течение всего исследования периодически спонтанно приходили в половую охоту, проявляющуюся такими характерными клиническими признаками, как вокализация, беспокойство, трение телом о стенки клетки, снижение аппетита, принятие характерной позы для спаривания и др. У кошек опытной группы аналогичные признаки наблюдали до начала применения препарата, а также после восстановления у них полового цикла между 1 и 2 этапами эксперимента. На основании этих признаков в тот же или на следующий день от начала половой охоты каждому животному опытной группы перорально вводили бигормональный препарат СЕКС БАРЬЕР по схеме для прерывания течки. В течение 3…5 дней применения препарата половая активность кошек значительно снижалась; к окончанию курса перечисленные поведенческие признаки полностью исчезали, тогда как у контрольных животных период половой охоты в среднем продолжался 7…15 дней. В период применения препарата по схеме для задержки течки (с сентября 2016 г. по август 2017 г. и с сентября 2017 по ноябрь 2018 г.) ни у одной кошки из опытной группы не было отмечено эстрального поведения. Кошки контрольной группы в течение всего периода исследования приходили в охоту со средней периодичностью 1 раз в три месяца.

УЗИ матки и яичников. Исходное УЗИ матки и яичников в июне 2016 г. показало нормальные размеры и структуру этих органов у всех кошек, включенных в исследование, что свидетельствовало об отсутствии у них патологии репродуктивных органов перед началом эксперимента.

При ультрасонографии органов малого таза на 3-м месяце эксперимента (август 2016 г.) на фоне применения препарата «СЕКС БАРЬЕР» по схеме для прерывания течки у всех кошек опытной группы было выявлено незначительное увеличение диаметра тела матки без изменения структуры органа. Однако по данным УЗИ матки, проведенного на 7-м месяце эксперимента (декабрь 2016 г.), у всех кошек опытной группы были зарегистрированы нормальные размеры органа, которые не изменялись до завершения исследования, хотя подопытные животные после выявленного отклонения в размерах матки на 3-м месяце продолжали постоянно получать препарат по схеме для задержки течки. На этом основании выявленное увеличение диаметра матки было интерпретировано как кратковременная реакция эндометрия на первое введение бигормонального контрацептивного препарата по схеме прерывания течки.

Параллельно проводившееся в ходе всего эксперимента УЗИ яичников не выявило патологических изменений в структуре этих органов ни у одной кошки. Это позволило исключить поликистоз и опухолевые процессы яичников.

Таким образом, при УЗИ репродуктивной сферы не было обнаружено какого-либо негативного влияния препарата на матку и яичники кошек в условиях его постоянного применения в течение 2-х лет.

Вагинальная цитология. В период проведения исследования оценивали вагинальную цитологию на фоне применения препарата. Результаты микроскопии вагинальных мазков подопытных животных свидетельствовали об отсутствии у них цитологических признаков эструса в течение всего эксперимента и полностью согласовывались с данными наблюдения за их поведением во время применения бигормонального препарата СЕКС БАРЬЕР по схемам для прерывания и задержки течки.

Цитологическая картина вагинальных мазков в контрольной группе была представлена различным соотношением безъядерных и ядерных клеток поверхностного эпителиального слоя. Это свидетельствовало о пребывании кошек в разных стадиях эстрального цикла. Начало течки и выраженные проявления половой охоты у животных контрольной группы регистрировались с периодичностью 1 раз в три месяца.

Таким образом, результаты цитологического исследования вагинальных мазков кошек опытной группы на фоне применения бигормонального контрацептивного препарата СЕКС БАРЬЕР для прерывания и задержки течки, характеризующиеся отсутствием клеточных признаков эстральной фазы полового цикла, коррелировали с отсутствием поведенческих признаков половой охоты. В контрольной группе анализ вагинальной цитологии свидетельствовал о пребывании животных в разных стадиях полового цикла.

Наблюдения за поведением кошек опытной группы, не проявлявших признаков половой охоты, и коррелирующие с ними результаты вагинальной цитологии с достаточной определенностью указывали на отсутствие у кошек, постоянно получавших «СЕКС БАРЬЕР», стадии эструса.

У кошек опытной и контрольной группы цитологическая картина вагинальных мазков в течение всего времени наблюдения не выявила наличия эритроцитов, бактерий и грибов, что является свидетельством отсутствия воспалительного процесса в половых путях [19].

Определение половых гормонов. Определяли концентрацию эстрадиола и прогестерона.

Эстрадиол. Результаты изучения динамики уровня эстрадиола у кошек опытной и контрольной группы представлены на рисунке 1.

Рис. 1. Динамика концентрации эстрадиола у кошек опытной и контрольной группы. Референсные интервалы ветеринарного лабораторно-диагностического центра «Неовет»: эструс ― 20…60 пг/мл, анэструс ― < 20 пг/мл

Fig. 1. Dynamics of estradiol level in experimental and control groups of the cats. Veterinary laboratory and diagnostic center «Neovet» reference range: estrus ― 20 ... 60 pg / ml, anestrus ― <20 pg / ml

Концентрация эстрадиола у кошек опытной группы в течение всего периода применения препарата по схеме для задержки течки соответствовала уровню, характерному для анэструса (менее 20 пг/мл). Этот результат полностью согласуется с отсутствием проявления эстрального поведения и результатами вагинальной цитологии.

Данные мониторинга уровня эстрадиола у кошек контрольной группы в ходе исследования в полной мере соответствуют представлению о естественных колебаниях концентрации этого полового стероида. Так, зафиксировано несколько «выходов» уровня эстрадиола в интервал значений, характерных для эструса (20…60 пг/мл), согласующихся с периодическим приходом контрольных животных в половую охоту и наличием у них признаков эструса в вагинальных мазках.

Прогестерон. В половом цикле кошек в фазе анэструса, проэструса и эструса до стадии овуляции уровень прогестерона сохраняется на базальном уровне (менее 2 нг/мл) [21]. В период овуляции концентрация прогестерона увеличивается и обычно находится в интервале  2…10 нг/мл. В случае оплодотворения яйцеклетки и наступления беременности уровень прогестерона продолжает повышаться и сохраняется  высоким весь период вынашивания плодов [21, 23]. Известно, что овуляция, следующая за «выбросом» ЛГ, у кошек носит в основном индуцибельный характер [21, 22], где стимулирующим процесс фактором является контакт с самцом. Принимая во внимание тот факт, что все кошки в ходе исследования находились в помещении стационара, где не было котов, а процесс спонтанной овуляции ― редкое явление, следовало ожидать, что у контрольных животных  прогестерон в течение всего эксперимента будет находиться на уровне, близком к базальному.

Что касается подопытных животных, находившихся в тех же условиях, что и контрольные, то, если длительный прием гестаген-содержащего контрацептивного препарата не приводит к каким-либо неожиданным сдвигам в гормональном статусе животного, мониторинг у них прогестерона должен был дать примерно те же результаты, что и у контрольных кошек. Результаты мониторинга уровня прогестерона у двух групп кошек, подтверждающие этот вывод, представлены на рисунке 2.

Рис. 2. Динамика концентрации прогестерона у кошек опытной и контрольной группы. Референсные интервалы ветеринарного лабораторно-диагностического центра «Неовет»: овуляция 2…10 нг/мл

Fig. 2. Dynamics of progesterone level in experimental and control groups of the cats. Veterinary laboratory and diagnostic center «Neovet» reference range: ovulation 2...10 ng / ml

Клинический и биохимический анализы крови. Наряду с детальным исследованием функции репродуктивных органов в течение всего периода эксперимента оценивали морфологические и биохимические параметры крови кошек.

Учитывая, что отслеживаемые морфологические и биохимические показатели крови у кошек опытной и контрольной групп находились в пределах физиологической нормы, периодичность их мониторинга со второй половины 2017 г. была скорректирована до 1 раза в 3…5 месяцев.

Морфологические показатели крови. Результаты ОАК кошек опытной и контрольной группы в период применения препарата «СЕКС БАРЬЕР» для задержки течки показали, что концентрация гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов существенно не изменялись и оставались в пределах контрольных значений (табл. 3). Это показывает безопасность длительного применения препарата в отношении возможных неблагоприятных воздействий на морфологию крови.

Биохимические показатели. При БАК в число определяемых маркеров были включены общий белок, креатинин и мочевина как индикаторы статуса белкового обмена; холестерин и триглицериды, как отражающие состояние жирового обмена; глюкоза как показатель состояния углеводного метаболизма. Как следует из данных, приведенных в таблице 4, все определявшиеся в ходе эксперимента биохимические показатели белкового, липидного и углеводного обмена у кошек обеих групп находились в пределах физиологической нормы. При этом достоверных различий между опытными и контрольными животными не установлено. На основании полученных результатов можно сделать вывод, что длительное применение бигормонального контрацептивного препарата по предлагаемым в инструкции схемам прекращения и задержки течки не приводит к появлению у кошек значимых сдвигов в основных звеньях обмена в организме. Это указывает на отсутствие негативного влияния длительного применения препарата на метаболизм макронутриентов.

3.         Результаты ОАК кошек в ходе выполнения эксперимента

3. The results of the complete blood count test of the cats during experiment

4.         Результаты биохимического анализа крови кошек в ходе выполнения эксперимента

4. The results of the biochemical blood test of the cats during experiment