Сокращения: ДНК ― дезоксирибонукдеиновая кислота, н.п. ― нуклеотидные последовательности, ПЦР ― полимеразно-цепная реакция   Введение Дыхательные пути человека и животных ― это резервуар микробиоты, состоящей из различных комменсалов и потенциальных патогенов, одним из которых является Staphylococcus aureus (S. aureus). S. aureus ― оппортунистический микроорганизм, вызывающий множество инфекционных заболеваний различной степени тяжести [6, 7, 10]. В последние годы интерес к нему возрос не только из-за его важной роли в медицине и ветеринарии, увеличения количества инфекционных процессов, вызываемых им, но также появлением клональных линий, связанных с различными видами животных (животными-компаньонами, домашним скотом, дикими животными), передачей возбудителя при контакте между животными и человеком. Тем самым, S. aureus проявляет все более очевидный зоонозный потенциал [7, 8]. Способность колонизировать различные виды хозяев поддерживается пластичным геномом S. aureus, содержащим большое количество генов патогенности [8]. Одним из основных регуляторов этих генов у золотистого стафилококка является система кворума (quorum sensing), служащая глобальным регулятором, так называемым регулятором вспомогательных генов (agr), которая контролирует экспрессию большинства факторов патогенности и образование биопленки [1]. Локус agr включает в себя пять генов (agrABCD и δ-гемолизин), при этом область agrD – agrC имеет вариабельную структуру, которая может изменяться между штаммами S. aureus. По вариабельным участкам agr делят на четыре группы (agr I, II, III и IV) с различной степенью вирулентности [1]. Предположительно, существует корреляция между типом agr и наличием некоторых генов патогенности [1, 9]. Как известно, патогенность стафилококков является результатом совместной деятельности выделяемых ими токсинов, ферментов и белков на поверхности бактериальной клетки, которые связываются с белками организма хозяина [10]. Эта колонизация обычно связана с набором факторов адгезии, которые способствуют прикреплению бактерий к поверхности хозяина с использованием компонента микробной поверхности, распознающего молекулы адгезивной матрицы (MSCRAMM). S. aureus экспрессирует около 20 различных MSCRAMM [10]. Основные белковые адгезины в этой группе включают в себя хлопьеобразующие факторы А и В (ClfA, ClfB), фибронектин-связывающие белки А и В (FnBPB, FnBPA). Помимо MSCRAMM S. aureus продуцирует ряд экзотоксинов, способствующих разрушению тканевой мембраны хозяина, тем самым обеспечивая питательными веществами растущие бактериальные клетки. Вырабатываемые экзотоксины включают в себя цитотоксины, лейкоцидин Пантона-Валентайна (PVL) и гемолизины (α-, β-, γ-), которые обладают способностью образовывать поры в клетках-хозяевах, таким образом обеспечивая лизис [1, 10]. Несмотря на то, что S. aureus колонизирует область носоглотки здоровых людей и животных, он может стать основным фактором риска для последующего развития инфекций, в том числе, пневмоний [1, 6, 10]. Стафилококковая пневмония у людей является распространенной и приводит к высокой смертности [4, 10]. В развитии пневмонии имеет значение лейкоцидин Пантона-Валентайна, который делает микроб более вирулентным [4]. Хотя, как сообщает Fan J. с соавторами, в настоящее время опасность pvl-позитивных штаммов еще недостаточно ясна, поскольку существуют другие факторы, способствующие патогенности S. aureus [4]. К сожалению, доступные сведения по молекулярно-генетическому исследованию S. aureus у животных, в том числе, обезьян, недостаточны и ограничены небольшим количеством стран. Сообщений о патогенном потенциале S. aureus, выделенных у обезьян при пневмониях, в зарубежной литературе нами не найдено.   Цель исследования Определить некоторые гены патогенности и их комбинацию у S. aureus, выделенных из носовой полости клинически здоровых обезьян и из легких обезьян, погибших от пневмонии.   Материалы и методы Исследовано 129 изолятов S. aureus, выделенных из носа 26 клинически здоровых обезьян и из легких 103 погибших, у которых на основании патоморфологического исследования поставлен диагноз «пневмония» (табл. 1). Все обезьяны содержались в условиях неволи в Адлерском питомнике, находящимся в ФГБНУ НИИ «медицинской приматологии» (г. Сочи, Россия). 1.      Характеристика обезьян, у которых выделен S. aureus Characteristics of monkeys from which S. aureus was isolated   Виды обезьян Общая численность Пол (n) Возраст, годы Материал исследования ♂ ♀ До 1 1…4 5…14 15 и старше мазок из носа легкие Макак резус 40 22 18 14 10 6 10 2 38 Макак яванский 48 17 31 11 16 18 3 13 35 Макак лапундер 3 3 0 2 0 1 0 1 2 Мартышка зелёная 1 1 0 1 0 0 0 0 1 Павиан анубис 5 2 3 4 0 1 0 0 5 Павиан гамадрил 30 20 10 19 6 5 0 8 22 Патас 2 1 1 0 2 0 0 2 0 Всего 129 66 63 51 34 31 13 26 103   Бактериальные изоляты. Для выделения стафилококков проводили стандартные бактериологическое и биохимическое исследования, как описано ранее [2]. Все изоляты S. aureus были собраны в течение 2017‒2019 гг. и хранились в смеси глицерина и мясо-пептонного бульона (50:50) при −20 °С до проведения настоящего исследования. Экстракция ДНК. Тотальную ДНК стафилококков выделяли из бактериальных суспензий, приготовленных из суточных агаровых культур S. aureus и суспендированных в 100 мкл раствора NaCl с использованием набора реактивов «ДНК-сорб-В» (ФБУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора», Россия) согласно рекомендации производителя. Молекулярно-генетическое исследование. Методом ПЦР с электрофоретической детекцией все изоляты протестированы нами на присутствие генетических детерминант патогенности ― маркеров лейкоцидина Пантон-Валейтайна (lukS/lukF-pvl), маркеров α- и β- гемолизинов (hla, hlb), генов фиброниктин-связывающих белков A и B (fnBpA, fnBpB) и хлопьеобразующих факторов A и B (clfA, clfB). Для определения наличия генов патогенности использовали специфические олигонуклеотидные праймеры (табл. 2), описанные в научных публикациях, и синтезированные фирмой «Evrogen» (Россия). Группы agr комплекса и pvl компоненты (lukS/F) анализировали с помощью мультиплексной ПЦР.   2.      Олигонуклеотидные последовательности праймеров, использованных в исследовании Oligonucleotide sequences of the primers used in the study   Ген Последовательность 5̍−3̍ Размер ампликона, н.п. Мишень Ссылка pvl1 F:GCATGAGTAACATCCATATT R:CCCATTAGTACACAGTGGTT 120 Субъединица S PVL [1] pvl2 F:TTCAACATCCCAACCAATTT R:AATACTCAAAGCTGCTGGAA 349 Субъединица F PVL [1] hla F:GTACTACAGATATTGGAAGC R:GTAATCAGATATTTGAGCTAC 274 Гемолизин А [10] hlb F:GCC AAA GCC GAA TCT AAG R:CGC ATA TAC ATC CCA TGG C 840 Гемолизин В [10] fnBpA F:GCGGAGATCAAAGACAA R:CCATCTATAGCTGTGTGG 1279 Фибро-нектин-связывающий белок А [10] fnBpB F:GGAGAAGGAATTAAGGCG R:GCCGTCGCCTTGAGCGT 820 Фибро-нектин-связывающий белок В [10] clfA F:CGCCGGTAACTGGTGAAGCT R:TGCTCTCATTCTAGGCGCACTT 314 Хлопьеобразующий фактор А [10] clfB F:ATGATCTTGCTTGCGTT R:CCGATTCAAGAGTTACACC 215 Хлопьеобразующий фактор В [10] agr loci (agrB) F:ATGCACATGGTGCACATGC **** Ген, контролирующий экспрессию факторов вирулентности [5]   agr I R:GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT 441 agr II R:TAT TAC TAA TTG AAA AGT GGC CAT AGC 575 agr III R:GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG 323 agr IV R: CGATAATGCCGTAATACCCG 659 Примечание. **** agr loci (agrB) ― это прямой праймер, который соединяется с обратными праймерами (agrI, II, III, IV) в реакции амплификации, при которой образуется ампликон. Именно ампликон имеет размеры, указанные в данной графе.   Геномную ДНК амплифицировали в 25 мкл реакционной смеси, включающей в себя 5 мкл амплификационной смеси «ScreenMix» («Evrogen»), 5 мкл праймеров, 5 мкл деонизированной воды и 10 мкл ДНК. Реакция амплификации шла в автоматически программируемом термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», Россия) по нескольким программам амплификации ДНК, разработанным с учетом свойств праймеров, участвующих в конкретной реакции (табл. 3).   3.      Режимы амплификации исследуемых генов патогенности Amplification processes of the studied pathogenicity genes   Ген Программа амплификации начальная денатурация денатурация, отжиг, пролонгация окончательная пролонгация pvl, hlb 95°С ― 5 мин 1 цикл 95 °С ― 10 с, 50 °С― 10 с,72 °С― 20 с 32 цикла 72 °С ― 2 мин 1 цикл hla 95°С ― 5 мин 1 цикл 95 °С ― 30 с, 47 °С ― 30 с,72 °С ― 45 с 38 циклов 72 °С ― 10 мин 1 цикл fnBpA 95°С ― 5 мин 1 цикл 95 °С ― 30 с, 48 °С ― 30 с,72 °С ― 45 с 35 циклов 72 °С ― 10 мин 1 цикл fnBpB 95°С ― 5 мин 1 цикл 95 °С ― 30 с, 56 °С ― 30 с,72 °С ― 45 с 35 циклов 72 °С ― 10 мин 1 цикл clfA 95°С ― 5 мин 1 цикл 95 °С ― 30 с, 55 °С ― 30 с,72 °С ― 45 с 30 циклов 72 °С ― 10 мин 1 цикл clfB 95°С ― 5 мин 1 цикл 95 °С ― 30 с, 47 °С ― 30 с,72 °С ― 45 с 30 циклов 72 °С ― 10 мин 1 цикл agr 95°С ― 5 мин 1 цикл 95 °С ― 10 с, 50 °С ― 10 с, 72 °С ― 20 с 32 цикла 72 °С ― 5 мин 1 цикл   Гель-электрофорез. Продукты амплификации визуализировали с помощью гель-электрофореза в 1,2%-м агарозном геле, окрашенном раствором этидиум бромида, в градиенте напряжения 90 В. Размер ампликонов определяли, используя ДНК-руллер, размером 100…1500 н. п. (ЗАО «Евроген»).   Результаты В настоящей работе мы акцентировали внимание на исследовании генов патогенности S. aureus, отвечающих за экспрессию лейкоцидина Пантон-Валентайна (pvl), адгезинов (fnBpA, fnBpB, clfA, clfB) и α-, β-гемолизинов (hla, hlb). У 129 изолятов S. aureus, выделенных из дыхательных путей обезьян, гены патогенности обнаружены в высоких процентах, при этом чаще детектированы гены хлопьеобразующих факторов clfA и clfB (95,4 %) и гены гемолизинов ― hla (83,7%), hlb (81,4%) (рис. 1). Рис. 1. Частота детекции генов патогенности у S. aureus, выделенных у обезьян Fig. 1. Detection frequency of pathogenicity genes of S. aureus isolated in monkeys   Ген α-гемолизина (hla) выявлен чаще у S. aureus, выделенных из легких обезьян при пневмониях (87,4 %), а ген β-гемолизина (hlb) обнаружен практически у всех S. aureus, изолированных из носовой полости клинически здоровых животных (96,2 %). Гены фибронектин-связывающих белков А и В (fnBpA, fnBpB) обнаружены чаще у изолятов, выделенных из носовой полости (92,3 %), при этом все 100 % S. aureus содержали гены хлопьеобразующих факторов (clfA, clfB). В то же время, у изолятов, выделенных из легких обезьян, погибших от пневмонии, чаще детектированы гены clfA и clfB (94,2 %), чем fnBpA и fnBpB (70 и 75,7 %, соответственно). Ген лейкоцидина Пантон-Валентайна (pvl) обнаружен практически с одинаковой частотой у S. aureus, изолированных как из легких, так и из носа у обезьян (47,6 и 50 %, соответственно). Как известно, данный ген является маркером повышенной патогенности штаммов золотистого стафилококка, поэтому играет важную роль в развитии инфекционного процесса [3]. Обнаружение pvl у 47,6 % изолятов S. aureus, выделенных при пневмониях, еще раз подтверждает сообщение об ассоциации данного лейкоцидина с развитием пневмонии стафилококковой природы. Agr-типирование показало, что наиболее распространенной была IV группа agr-комплекса (рис. 1), более половины исследованных S. aureus относилось к этой группе (55,8 %). Agr III группы обнаружена в 2,9 % только у изолятов, выделенных из легких обезьян при пневмонии. Почти в 2,5 раза чаще у S. aureus, выявленных в носовой полости обезьян, обнаружена группа agr II (11,5 %). В ходе исследования у 5 изолятов, выделенных из легких (4,9 %), не получилось идентифицировать группу регуляторного гена (рис. 1). Анализ комбинации генов, кодирующих гемолизины и адгезины у изученных S. aureus, показал, что они встречались по два, четыре и шесть генов (табл. 4).   4.      Частота выявления комбинаций генов патогенности у изолятов S. aureus, выделенных у обезьян Detection frequency of combination of pathogenicity genes of S. aureus isolated in monkeys Комбинации генов патогенности Назальные образцы, n/% Образцы из легких, n/% Всего, n/% hla-hlb 18/69,2 69/66,9 87/67,5 fnBpA-fnBpB 22/84,6 63/61,2 85/65,9 clfA-clfB 25/96,2 88/85,4 113/87,6 hla-hlb-fnBpA-fnBpB 0 1/0,9 1/0,8 hla-hlb-clfA-clfB 4/15,4 21/20,4 25/19,4 fnBpA-fnBpB-clfA-clfB 6/23,1 13/12,6 18/13,9 hla-hlb-fnBpA-fnBpB-clfA-clfB 14/53,9 48/46,6 62/48,1 pvl-hla-hlb- fnBpA-fnBpB-clfA-clfB 9/34,6 23/22,3 32/24,8 pvl-hlb- fnBpA-fnBpB-clfA-clfB 2/7,7 3/2,9 5/3,9 pvl-hla-hlb- fnBpA- clfA-clfB 1/3,9 2/1,9 3/2,3 pvl-hla-hlb- fnBpB-clfA-clfB 1/3,9 6/5,8 7/5,4 pvl-hla- fnBpA-fnBpB-clfA-clfB - 4/3,9 4/3,9   Как видно из таблицы, наиболее часто отмечено сочетание хлопьеобразующих факторов A и B (87,6 %). Одновременное присутствие фибриноген-связывающих белков A и B и хлопьеобразующих факторов A и B в геномах золотистых стафилококков, выделенных из носа почти в 2 раза выше, чем из легких (23,1 и 12,6 %, соответственно). Геновариант fnBpB-clfA-clfB был детектирован в 13 (10,1 %) случаях, у 10 (7,8 %) изолятов S. aureus обнаружен вариант fnBpA-clfA-clfB. Присутствие одновременно генов двух гемолизинов (hla, hlb) выявлено более чем у 60 % изученных S. aureus (см. табл. 4). Комбинация двух генов гемолизинов и адгезинов (hla-hlb-fnBpA-fnBpB-clfA-clfB) отмечена почти у половины изолятов (48,1 %). Сочетание данных генов с геном лейкоцидина Пантон-Валентайна в геноме S. aureus выявлено у 23 (22,3 %) изолятов, выделенных из легких, и у 9 (34,6 %) изолятов, выделенных из носа. Несмотря на то, что многие сочетания изученных генов представлены в единичных случаях, разнообразие этих комбинаций значительно выше в геноме S. aureus, выделенных из легких.   Обсуждение и заключение В нашей работе впервые представлены сведения о патогенном потенциале S. aureus, выделенных из дыхательных путей (носовой полости и легких) обезьян различных видов, содержащихся в условиях неволи. Гены факторов патогенности S. aureus, такие как лейкоцидин Пантон-Валентайна, фибриноген-связывающих белков и хлопьеобразующих факторов, обнаружены с высокой частотой у изолятов S. aureus, выделенных из дыхательных путей обезьян. Гены адгезинов и гемолизинов, играют одну из важных ролей в развитии инфекционного процесса, так как продукты их экспрессии также участвуют в образовании биопленки. Изученные гены патогенности могут присутствовать в геноме золотистого стафилококка в различных сочетаниях, но чаще выявляются геноварианты, включающие в себя одновременно комбинацию всех вышеупомянутых генов. Важное значение имеет детекция гена лейкоцидина Пантон-Валентайна, который является маркером тяжелого инфекционного процесса [3, 8]. В ходе исследования установлено, что данный ген содержится в геноме почти половины изолятов S. aureus, выделенных из дыхательных путей обезьян. Большинство изученных изолятов принадлежало к IV группе регуляторного гена, на втором месте по распространенности стоит agr I, к тому же, у 4,9 % S. aureus, обнаруженных в легких обезьян, погибших от пневмонии, не удалось идентифицировать группу agr-комплекса. Данные нашего исследования отличаются от данных по распространению аллелей комплекса agr у изолятов S. aureus, выделенных от людей, где превалируют золотистые стафилококки, относящиеся к agr I [1]. Как показало настоящее исследование, нечеловекообразные приматы, также как и люди, являются естественными носителями S. aureus. Следовательно, обезьяны могут служить естественной моделью для изучения назального носительства S. aureus. ПЦР может использоваться для подтверждения патогенности изолятов S. aureus, выделенных из различного биоматериала животных, и служить критерием эпидемиологической оценки при изучении циркуляции золотистого стафилококка в стаде обезьян питомника.   Конфликт интересов Автор статьи не имеет финансовых или личных отношений с другими лицами или организациями, которые могли бы повлиять на достоверность или содержание этой работы.