PATHOGENIC POTENTIAL OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS COLONIZING THE NASAL CAVITY AND LUNGS OF MONKEYS
Abstract and keywords
Abstract (English):
In this paper, data are presented on the study of genetic determinants of pathogenicity in S. aureus isolated from the respiratory tract of monkeys (nasal cavity and lungs) collected during 2017‒2019. The aim of this work is to determine some genes of pathogenicity and their combinations in S. aureus isolated from the nasal cavity of clinically healthy monkeys and from the lungs of monkeys that died from pneumonia. There was a high frequency of detection of adhesion genes (fnBpA ― 74.4 %, fnBpB ― 79.1 %, clfA ― 95.4 %, clfB ― 95.4 %), hemolysins (hla ― 83.7 %, hlb ― 81.4 %), Panton-Valentine leukocidin (pvl ― 48.1 %), which are regarded as markers of the increased pathogenicity of the microbe, as well as combinations of various genovariants. The hemolysin α gene was detected more often in S. aureus isolated from the lungs of monkeys with pneumonia (87.4 %), and the hemolysin β gene was found in almost all S. aureus isolated from the nasal cavity (96.2 %). Genes for fibronectin-binding proteins (fnBpA/B) were found with a high frequency in isolates detected from the nasal cavity, while the clumping factor gene (clfA/B) were isolated in 100 % of S. aureus studied. The genovariant hla-hlb-fnBpA-fnBpB-clfA-clfB was detected in almost half of the isolates (48.1%), the presence of all studied pathogenicity determinants (pvl-hla-hlb-fnBpA-fnBpB-clfA-clfB) was noted in 24.8 % S. aureus. Analysis of the high frequency of prevalence of genes responsible for the expression of pathogenicity factors confirms the pathogenicity of studied S. aureus isolates, detected in monkeys. Most of the isolates belonged to group IV of the regulatory gene (55.8%) and agr I takes second place (40.8 %). PCR detection of pvl, hla, hlb, fnBpA, fnBpB, clfA, clfB genes can be used to demonstrate the pathogenicity of S. aureus isolates from various animal biomaterials and serve as a criterion for epidemiological assessment in studying the S. aureus circulation in monkeys kept in captivity.

Keywords:
monkeys, genetic determinants of pathogenicity, agr typing, Panton-Valentine leukocidin (pvl), adhesions, hemolysins, Staphylococcus aureus
Text
Publication text (PDF): Read Download

Сокращения: ДНК ― дезоксирибонукдеиновая кислота, н.п. ― нуклеотидные последовательности, ПЦР ― полимеразно-цепная реакция

 

Введение

Дыхательные пути человека и животных ― это резервуар микробиоты, состоящей из различных комменсалов и потенциальных патогенов, одним из которых является Staphylococcus aureus (Saureus). Saureus ― оппортунистический микроорганизм, вызывающий множество инфекционных заболеваний различной степени тяжести [6, 7, 10]. В последние годы интерес к нему возрос не только из-за его важной роли в медицине и ветеринарии, увеличения количества инфекционных процессов, вызываемых им, но также появлением клональных линий, связанных с различными видами животных (животными-компаньонами, домашним скотом, дикими животными), передачей возбудителя при контакте между животными и человеком. Тем самым, Saureus проявляет все более очевидный зоонозный потенциал [7, 8]. Способность колонизировать различные виды хозяев поддерживается пластичным геномом Saureus, содержащим большое количество генов патогенности [8]. Одним из основных регуляторов этих генов у золотистого стафилококка является система кворума (quorum sensing), служащая глобальным регулятором, так называемым регулятором вспомогательных генов (agr), которая контролирует экспрессию большинства факторов патогенности и образование биопленки [1]. Локус agr включает в себя пять генов (agrABCD и δ-гемолизин), при этом область agrD – agrC имеет вариабельную структуру, которая может изменяться между штаммами S. aureus. По вариабельным участкам agr делят на четыре группы (agr IIIIII и IVс различной степенью вирулентности [1]. Предположительно, существует корреляция между типом agr и наличием некоторых генов патогенности [1, 9]. Как известно, патогенность стафилококков является результатом совместной деятельности выделяемых ими токсинов, ферментов и белков на поверхности бактериальной клетки, которые связываются с белками организма хозяина [10]. Эта колонизация обычно связана с набором факторов адгезии, которые способствуют прикреплению бактерий к поверхности хозяина с использованием компонента микробной поверхности, распознающего молекулы адгезивной матрицы (MSCRAMM). Saureus экспрессирует около 20 различных MSCRAMM [10]. Основные белковые адгезины в этой группе включают в себя хлопьеобразующие факторы А и В (ClfAClfB), фибронектин-связывающие белки А и В (FnBPBFnBPA). Помимо MSCRAMM S. aureus продуцирует ряд экзотоксинов, способствующих разрушению тканевой мембраны хозяина, тем самым обеспечивая питательными веществами растущие бактериальные клетки. Вырабатываемые экзотоксины включают в себя цитотоксины, лейкоцидин Пантона-Валентайна (PVL) и гемолизины (α-, β-, γ-), которые обладают способностью образовывать поры в клетках-хозяевах, таким образом обеспечивая лизис [1, 10].

Несмотря на то, что S. aureus колонизирует область носоглотки здоровых людей и животных, он может стать основным фактором риска для последующего развития инфекций, в том числе, пневмоний [1, 6, 10]. Стафилококковая пневмония у людей является распространенной и приводит к высокой смертности [4, 10]. В развитии пневмонии имеет значение лейкоцидин Пантона-Валентайна, который делает микроб более вирулентным [4]. Хотя, как сообщает Fan J. с соавторами, в настоящее время опасность pvl-позитивных штаммов еще недостаточно ясна, поскольку существуют другие факторы, способствующие патогенности Saureus [4]. К сожалению, доступные сведения по молекулярно-генетическому исследованию Saureus у животных, в том числе, обезьян, недостаточны и ограничены небольшим количеством стран. Сообщений о патогенном потенциале Saureus, выделенных у обезьян при пневмониях, в зарубежной литературе нами не найдено.

 

Цель исследования

Определить некоторые гены патогенности и их комбинацию у Saureus, выделенных из носовой полости клинически здоровых обезьян и из легких обезьян, погибших от пневмонии.

 

Материалы и методы

Исследовано 129 изолятов Saureus, выделенных из носа 26 клинически здоровых обезьян и из легких 103 погибших, у которых на основании патоморфологического исследования поставлен диагноз «пневмония» (табл. 1). Все обезьяны содержались в условиях неволи в Адлерском питомнике, находящимся в ФГБНУ НИИ «медицинской приматологии» (г. Сочи, Россия).

1.      Характеристика обезьян, у которых выделен Saureus

Characteristics of monkeys from which S. aureus was isolated

 

Виды обезьян

Общая численность

Пол (n)

Возраст, годы

Материал исследования

До 1

1…4

5…14

15 и старше

мазок из носа

легкие

Макак резус

40

22

18

14

10

6

10

2

38

Макак яванский

48

17

31

11

16

18

3

13

35

Макак лапундер

3

3

0

2

0

1

0

1

2

Мартышка зелёная

1

1

0

1

0

0

0

0

1

Павиан анубис

5

2

3

4

0

1

0

0

5

Павиан гамадрил

30

20

10

19

6

5

0

8

22

Патас

2

1

1

0

2

0

0

2

0

Всего

129

66

63

51

34

31

13

26

103

 

Бактериальные изолятыДля выделения стафилококков проводили стандартные бактериологическое и биохимическое исследования, как описано ранее [2]. Все изоляты Saureus были собраны в течение 2017‒2019 гг. и хранились в смеси глицерина и мясо-пептонного бульона (50:50) при −20 °С до проведения настоящего исследования.

Экстракция ДНК. Тотальную ДНК стафилококков выделяли из бактериальных суспензий, приготовленных из суточных агаровых культур S. aureus и суспендированных в 100 мкл раствора NaCl с использованием набора реактивов «ДНК-сорб-В» (ФБУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора», Россия) согласно рекомендации производителя.

Молекулярно-генетическое исследование. Методом ПЦР с электрофоретической детекцией все изоляты протестированы нами на присутствие генетических детерминант патогенности ― маркеров лейкоцидина Пантон-Валейтайна (lukS/lukF-pvl), маркеров α- и β- гемолизинов (hlahlb), генов фиброниктин-связывающих белков A и B (fnBpAfnBpB) и хлопьеобразующих факторов A и B (clfAclfB). Для определения наличия генов патогенности использовали специфические олигонуклеотидные праймеры (табл. 2), описанные в научных публикациях, и синтезированные фирмой «Evrogen» (Россия). Группы agr комплекса и pvl компоненты (lukS/F) анализировали с помощью мультиплексной ПЦР.

 

2.      Олигонуклеотидные последовательности праймеров, использованных в исследовании

Oligonucleotide sequences of the primers used in the study

 

Ген

Последовательность 5̍−3̍

Размер ампликона, н.п.

Мишень

Ссылка

pvl1

F:GCATGAGTAACATCCATATT

R:CCCATTAGTACACAGTGGTT

120

Субъединица S PVL

[1]

pvl2

F:TTCAACATCCCAACCAATTT

R:AATACTCAAAGCTGCTGGAA

349

Субъединица F PVL

[1]

hla

F:GTACTACAGATATTGGAAGC

R:GTAATCAGATATTTGAGCTAC

274

Гемолизин А

[10]

hlb

F:GCC AAA GCC GAA TCT AAG

R:CGC ATA TAC ATC CCA TGG C

840

Гемолизин В

[10]

fnBpA

F:GCGGAGATCAAAGACAA

R:CCATCTATAGCTGTGTGG

1279

Фибро-нектин-связывающий белок А

[10]

fnBpB

F:GGAGAAGGAATTAAGGCG

R:GCCGTCGCCTTGAGCGT

820

Фибро-нектин-связывающий белок В

[10]

clfA

F:CGCCGGTAACTGGTGAAGCT

R:TGCTCTCATTCTAGGCGCACTT

314

Хлопьеобразующий фактор А

[10]

clfB

F:ATGATCTTGCTTGCGTT

R:CCGATTCAAGAGTTACACC

215

Хлопьеобразующий фактор В

[10]

agr loci (agrB)

F:ATGCACATGGTGCACATGC

****

Ген, контролирующий экспрессию факторов вирулентности

[5]

 

agr I

R:GTCACAAGTACTATAAGCTGCGAT

441

agr II

R:TAT TAC TAA TTG AAA AGT GGC CAT AGC

575

agr III

R:GTAATGTAATAGCTTGTATAATAATACCCAG

323

agr IV

R: CGATAATGCCGTAATACCCG

659

Примечание. **** agr loci (agrB) ― это прямой праймер, который соединяется с обратными праймерами (agrIIIIIIIV) в реакции амплификации, при которой образуется ампликон. Именно ампликон имеет размеры, указанные в данной графе.

 

Геномную ДНК амплифицировали в 25 мкл реакционной смеси, включающей в себя 5 мкл амплификационной смеси «ScreenMix» («Evrogen»), 5 мкл праймеров, 5 мкл деонизированной воды и 10 мкл ДНК. Реакция амплификации шла в автоматически программируемом термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», Россия) по нескольким программам амплификации ДНК, разработанным с учетом свойств праймеров, участвующих в конкретной реакции (табл. 3).

 

3.      Режимы амплификации исследуемых генов патогенности

Amplification processes of the studied pathogenicity genes

 

Ген

Программа амплификации

начальная денатурация

денатурация, отжиг, пролонгация

окончательная пролонгация

pvl, hlb

95°С ― 5 мин

1 цикл

95 °С ― 10 с, 50 °С― 10 с,72 °С― 20 с

32 цикла

72 °С ― 2 мин

1 цикл

hla

95°С ― 5 мин

1 цикл

95 °С ― 30 с, 47 °С ― 30 с,72 °С ― 45 с

38 циклов

72 °С ― 10 мин

1 цикл

fnBpA

95°С ― 5 мин

1 цикл

95 °С ― 30 с, 48 °С ― 30 с,72 °С ― 45 с

35 циклов

72 °С ― 10 мин

1 цикл

fnBpB

95°С ― 5 мин

1 цикл

95 °С ― 30 с, 56 °С ― 30 с,72 °С ― 45 с

35 циклов

72 °С ― 10 мин

1 цикл

clfA

95°С ― 5 мин

1 цикл

95 °С ― 30 с, 55 °С ― 30 с,72 °С ― 45 с

30 циклов

72 °С ― 10 мин

1 цикл

clfB

95°С ― 5 мин

1 цикл

95 °С ― 30 с, 47 °С ― 30 с,72 °С ― 45 с

30 циклов

72 °С ― 10 мин

1 цикл

agr

95°С ― 5 мин

1 цикл

95 °С ― 10 с, 50 °С ― 10 с, 72 °С ― 20 с

32 цикла

72 °С ― 5 мин

1 цикл

 

Гель-электрофорезПродукты амплификации визуализировали с помощью гель-электрофореза в 1,2%-м агарозном геле, окрашенном раствором этидиум бромида, в градиенте напряжения 90 В. Размер ампликонов определяли, используя ДНК-руллер, размером 100…1500 н. п. (ЗАО «Евроген»).

 

Результаты

В настоящей работе мы акцентировали внимание на исследовании генов патогенности Saureus, отвечающих за экспрессию лейкоцидина Пантон-Валентайна (pvl), адгезинов (fnBpAfnBpBclfAclfB) и α-, β-гемолизинов (hlahlb).

У 129 изолятов Saureus, выделенных из дыхательных путей обезьян, гены патогенности обнаружены в высоких процентах, при этом чаще детектированы гены хлопьеобразующих факторов clfA и clfB (95,4 %) и гены гемолизинов ― hla (83,7%), hlb (81,4%) (рис. 1).

Рис. 1. Частота детекции генов патогенности у Saureus, выделенных у обезьян

Fig. 1. Detection frequency of pathogenicity genes of S. aureus isolated in monkeys

 

Ген α-гемолизина (hla) выявлен чаще у Saureus, выделенных из легких обезьян при пневмониях (87,4 %), а ген β-гемолизина (hlb) обнаружен практически у всех Saureus, изолированных из носовой полости клинически здоровых животных (96,2 %). Гены фибронектин-связывающих белков А и В (fnBpAfnBpB) обнаружены чаще у изолятов, выделенных из носовой полости (92,3 %), при этом все 100 % Saureus содержали гены хлопьеобразующих факторов (clfAclfB). В то же время, у изолятов, выделенных из легких обезьян, погибших от пневмонии, чаще детектированы гены clfA и clfB (94,2 %), чем fnBpA и fnBpB (70 и 75,7 %, соответственно). Ген лейкоцидина Пантон-Валентайна (pvl) обнаружен практически с одинаковой частотой у Saureus, изолированных как из легких, так и из носа у обезьян (47,6 и 50 %, соответственно). Как известно, данный ген является маркером повышенной патогенности штаммов золотистого стафилококка, поэтому играет важную роль в развитии инфекционного процесса [3]. Обнаружение pvl у 47,6 % изолятов Saureusвыделенных при пневмониях, еще раз подтверждает сообщение об ассоциации данного лейкоцидина с развитием пневмонии стафилококковой природы.

Agr-типирование показало, что наиболее распространенной была IV группа agr-комплекса (рис. 1), более половины исследованных Saureus относилось к этой группе (55,8 %). Agr III группы обнаружена в 2,9 % только у изолятов, выделенных из легких обезьян при пневмонии. Почти в 2,5 раза чаще у Saureus, выявленных в носовой полости обезьян, обнаружена группа agr II (11,5 %). В ходе исследования у 5 изолятов, выделенных из легких (4,9 %), не получилось идентифицировать группу регуляторного гена (рис. 1).

Анализ комбинации генов, кодирующих гемолизины и адгезины у изученных Saureus, показал, что они встречались по два, четыре и шесть генов (табл. 4).

 

4.      Частота выявления комбинаций генов патогенности у изолятов Saureus, выделенных у обезьян

Detection frequency of combination of pathogenicity genes of S. aureus isolated in monkeys

Комбинации генов патогенности

Назальные образцы, n/%

Образцы из легких, n/%

Всего, n/%

hla-hlb

18/69,2

69/66,9

87/67,5

fnBpA-fnBpB

22/84,6

63/61,2

85/65,9

clfA-clfB

25/96,2

88/85,4

113/87,6

hla-hlb-fnBpA-fnBpB

0

1/0,9

1/0,8

hla-hlb-clfA-clfB

4/15,4

21/20,4

25/19,4

fnBpA-fnBpB-clfA-clfB

6/23,1

13/12,6

18/13,9

hla-hlb-fnBpA-fnBpB-clfA-clfB

14/53,9

48/46,6

62/48,1

pvl-hla-hlbfnBpA-fnBpB-clfA-clfB

9/34,6

23/22,3

32/24,8

pvl-hlbfnBpA-fnBpB-clfA-clfB

2/7,7

3/2,9

5/3,9

pvl-hla-hlbfnBpAclfA-clfB

1/3,9

2/1,9

3/2,3

pvl-hla-hlbfnBpB-clfA-clfB

1/3,9

6/5,8

7/5,4

pvl-hlafnBpA-fnBpB-clfA-clfB

-

4/3,9

4/3,9

 

Как видно из таблицы, наиболее часто отмечено сочетание хлопьеобразующих факторов A и B (87,6 %). Одновременное присутствие фибриноген-связывающих белков A и B и хлопьеобразующих факторов A и B в геномах золотистых стафилококков, выделенных из носа почти в 2 раза выше, чем из легких (23,1 и 12,6 %, соответственно). Геновариант fnBpB-clfA-clfB был детектирован в 13 (10,1 %) случаях, у 10 (7,8 %) изолятов Saureus обнаружен вариант fnBpA-clfA-clfB. Присутствие одновременно генов двух гемолизинов (hlahlb) выявлено более чем у 60 % изученных Saureus (см. табл. 4). Комбинация двух генов гемолизинов и адгезинов (hla-hlb-fnBpA-fnBpB-clfA-clfB) отмечена почти у половины изолятов (48,1 %). Сочетание данных генов с геном лейкоцидина Пантон-Валентайна в геноме Saureus выявлено у 23 (22,3 %) изолятов, выделенных из легких, и у 9 (34,6 %) изолятов, выделенных из носа. Несмотря на то, что многие сочетания изученных генов представлены в единичных случаях, разнообразие этих комбинаций значительно выше в геноме Saureus, выделенных из легких.

 

Обсуждение и заключение

В нашей работе впервые представлены сведения о патогенном потенциале Saureus, выделенных из дыхательных путей (носовой полости и легких) обезьян различных видов, содержащихся в условиях неволи.

Гены факторов патогенности Saureus, такие как лейкоцидин Пантон-Валентайна, фибриноген-связывающих белков и хлопьеобразующих факторов, обнаружены с высокой частотой у изолятов Saureus, выделенных из дыхательных путей обезьян. Гены адгезинов и гемолизинов, играют одну из важных ролей в развитии инфекционного процесса, так как продукты их экспрессии также участвуют в образовании биопленки. Изученные гены патогенности могут присутствовать в геноме золотистого стафилококка в различных сочетаниях, но чаще выявляются геноварианты, включающие в себя одновременно комбинацию всех вышеупомянутых генов. Важное значение имеет детекция гена лейкоцидина Пантон-Валентайна, который является маркером тяжелого инфекционного процесса [3, 8]. В ходе исследования установлено, что данный ген содержится в геноме почти половины изолятов Saureus, выделенных из дыхательных путей обезьян. Большинство изученных изолятов принадлежало к IV группе регуляторного гена, на втором месте по распространенности стоит agr I, к тому же, у 4,9 % Saureus, обнаруженных в легких обезьян, погибших от пневмонии, не удалось идентифицировать группу agr-комплекса. Данные нашего исследования отличаются от данных по распространению аллелей комплекса agr у изолятов Saureus, выделенных от людей, где превалируют золотистые стафилококки, относящиеся к agr I [1].

Как показало настоящее исследование, нечеловекообразные приматы, также как и люди, являются естественными носителями Saureus. Следовательно, обезьяны могут служить естественной моделью для изучения назального носительства Saureus.

ПЦР может использоваться для подтверждения патогенности изолятов Saureus, выделенных из различного биоматериала животных, и служить критерием эпидемиологической оценки при изучении циркуляции золотистого стафилококка в стаде обезьян питомника.

 

Конфликт интересов

Автор статьи не имеет финансовых или личных отношений с другими лицами или организациями, которые могли бы повлиять на достоверность или содержание этой работы.

 

References

1. Gostev, V.V. Rasprostranenie genov kompleksa Immune evasion cluster i drugih faktorov virulentnosti u Staphylococcus aureus / V.V. Gostev, A.E. Goncharov, M.A. Gracheva, S.V. Sidorenko // Klin. mikrobiol. antimikrob. himioter. - 2013. - № 15(14). - S. 270-278.

2. Kalashnikova, V.A. Pnevmonii u obez'yan, soderzhaschihsya v usloviyah nevoli: chastota gibeli zhivotnyh, sezonnost' zabolevaniya i mikrobnye associacii / V.A. Kalashnikova // Rossiyskiy veterinarnyy zhurnal. - 2018. - № 4. - S. 15-18.

3. Sharkova, V.A. Geneticheskie markery patogennosti i antibiotikorezistentonosti shtammov S. epidermidis i S. aureus, izolirovannyh iz razlichnyh biotopov / V.A. Sharkova, E.F. Layman // Dal'nevostochnyy medicinskiy zhurnal. - 2013. - № 3. - S. 28-31.

4. Fan, J. Biogeography and Virulence of Staphylococcus aureus / J. Fan, M. Shu, G. Zhang, W. Zhou, Y. Jiang, Y. Zhu, G. Chen, Sh.J. Peacock, Ch. Wan, W. Pan, E.J. Feil // PLoS ONE. - 2009. - 4(7). - e6216. doi:10.1371/ journal.pone.0006216.

5. Gilot, P. Analysis of the Genetic Variability of Genes Encoding the RNA III-Activating Components Agr and TRAP in a Population of Staphylococcus aureus Strains Isolated from Cows with Mastitis / P. Gilot, G. Lina, T. Cochard, B. Poutrel // J. of Clin. Microbiol. - 2002. - No. 40(11). - pp. 4060-4067. doi:https://doi.org/10.1128/JCM.40.11.4060-4067.2002

6. Jenkins, A. Differential Expression and Roles of Staphylococcus aureus Virulence Determinants during Colonization and Disease / A. Jenkins, B. A. Diep, T.T. Mai, N.H. Vo, P. Warrener, J. Suzich, C.K. Stover, B.R. Sellman // mBio. - 2015. - Vol. 6, Is.1. - e02272-14.

7. Lozano, C. Staphylococcus aureus in Animals and Food: Methicillin Resistance, Prevalence and Population Structure. A Review in the African Continent / C. Lozano, H. Gharsa, K.B. Slama, M. Zarazaga, C. Torres // Microorganisms. - 2016. - No. 4 (12). - pp. 1-19 doihttps://doi.org/10.3390/microorganisms4010012.

8. Morgene, M.F. Staphylococcus aureus colonization and non-influenza respiratory viruses: Interactions and synergism mechanisms / M.F. Morgene, E. Botelho-Nevers, F. Grattard, S. Pillet, P. Berthelot, et al. // Virulence. - 2018. - Vol. 9. - No. 1. - pp. 1354-1363. https://doi.org/10.1080/21505594.2018.1504561.

9. Rodriguez, E.A. Differences in Epidemiological and Molecular Characteristics of Nasal Colonization with Staphylococcus aureus (MSSA-MRSA) in Children from a University Hospital and Day Care Centers / E.A. Rodriguez, M.M. Correa, S. Ospina, S.L. Atehortúa, J.N. Jiménez // PLoS ONE. - 2014. - No. 9(7). - e101417. doihttps://doi.org/10.1371/journal.pone.0101417.

10. Waryah, C.B. Diversity of Virulence Factors Associated with West Australian Methicillin-Sensitive Staphylococcus aureus Isolates of Human Origin / C.B. Waryah, J. Gogoi-Tiwari, K. Wells, K. Y. Eto, E. Masoumi // BioMed. Research International. - 2016. - Article ID 8651918. - 10 pages. http://dx.doi.org/10.1155/2016/8651918.

Login or Create
* Forgot password?